一种建立于dCas9工程化修饰蛋白及生物膜层干涉技术基础上的检测核酸的方法技术

本发明专利技术公开了建立于dCas9工程化修饰蛋白及生物膜层干涉技术基础上的检测核酸的方法。所述CRISPR‑BLI检测芯片包括：BLI感受器和固定在BLI感受器上的CRISPR探针；所述CRISPR探针由biotin‑dCas9‑Halo功能化蛋白和sgRNA复合而成；所述biotin‑dCas9‑Halo功能化蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。基于CRISPR‑BLI检测芯片，本发明专利技术构建出一种实时、快速、序列特异识别的检测核酸新方法；其中，目标DNA被固定于芯片表面的dCas9‑Halo‑biotin特异性捕获，改变芯片表面的光学性质，通过膜层干涉对芯片表面检测对DNA进行快速相应，可在9分钟内实现体系中840pmol/L核酸的特异性检出，为高通量输出快速准确的核酸检测结果提供有效手段。

【技术实现步骤摘要】
一种建立于dCas9工程化修饰蛋白及生物膜层干涉技术基础上的检测核酸的方法
本专利技术属于生物工程
，涉及一种建立于dCas9工程化修饰蛋白及生物膜层干涉技术基础上的检测核酸的方法，特别是涉及一种基于biotin-dCas9-Halo功能化蛋白的CRISPR-BLI检测芯片及其应用。
技术介绍
对病理学相关靶序列标志物的明确促进了核酸检测方法和分子诊断的发展。核酸检测在疾病、食品安全、环境监测等领域有着广泛的应用。其中一些方法在临床环境中发挥着关键作用，提供指导治疗的精确信息，监测患者状况、改善预后。目前广泛应用于靶序列检测的方法有聚合酶链反应(PCR)、基因测序和原位杂交。然而，这些类核酸检测方法大多数较为耗时，需要繁琐的样品处理和试剂配置、探针标记或昂贵仪器支持。因此，发展更适用于临床分子诊断的快速、简便的策略十分迫切。生物层干涉技术(Biolayerinterferometry，BLI)是一种实时、灵敏、快速的分析技术，通过监测BLI传感器上光学层厚度的变化来检测生物分子间的相互作用。BLI目前已经广泛地应用于抗原抗体、药物筛选等重要的医疗卫生领域，在分析生物分子间的相互作用、结合率、解离率和结合特异性等方面具有优势，被许多研究证实为一种快速、敏感、便捷的检测手段。因此，BLI技术作为一种靶向核酸检测方法具有很大的潜力。CRISPR/Cas是一系列在单链RNA(sgRNA)引导下特异性识别靶序列的核酸酶，核酸。这种基因“魔剪”已经扩展到几乎所有的基因组目标，并被视为一种新型的核酸感受器受到越来越多的关注。dCas9作为CRISPR/Cas9的突变体，其RuvC1和HNH结构域中的两个核酸酶活性位点同时发生突变，使其失去核酸酶活力但仍可对核酸特异性识别，因此dCas9可避免了Cas9酶切功能对待检测基因进行剪切等不良作用而作为核酸感受器应用于核酸实现核酸检测中。专利CN107574226A通过利用Ru(bpy)32+修饰的dCas9和磁性微球构建一种核酸检测技术。但在核酸的实际检测过程中，Ru(bpy)32+强正电性都会导致核酸的非特异性结合捕获，同时检测过程需要多步骤的处理，这使得检测体系复杂耗时，检测特异性减弱。但目前还很少见有将dCas9与BLI技术联合检测核酸的报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种基于biotin-dCas9-Halo功能化蛋白的CRISPR-BLI检测芯片及其应用。本专利技术通过Halo标签生物特性对dCas9-Halo蛋白进行生物素标记，得到一种biotin-dCas9-Halo工程化的修饰蛋白；在此基础上，制备CRISPR探针，并将其固定化到BLI传感器表面获得CRISPR-BLI检测芯片；利用CRISPR-BLI检测芯片对核酸的光学信号响应构建一种实时、快速、特异、高通量的核酸检测方法，在无需扩增的条件下就可对核酸进行检测，方法灵敏度高、特异性好。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种CRISPR-BLI检测芯片，包括：BLI感受器和固定在BLI感受器上的CRISPR探针；所述CRISPR探针由biotin-dCas9-Halo功能化蛋白和sgRNA复合而成；所述biotin-dCas9-Halo功能化蛋白为dCas9-Halo蛋白经生物素定点修饰获得，dCas9-Halo蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。优选的，所述sgRNA的序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术的第二方面，提供上述CRISPR-BLI检测芯片的制备方法，包括以下步骤：(1)将编码dCas9和Halo标签的基因序列连接到表达载体上，获得重组表达质粒，并转化到大肠杆菌中进行原核表达，分离纯化得到dCas9-Halo蛋白；将dCas9-Halo蛋白进行生物素定点修饰，制备得到biotin-dCas9-Halo功能化蛋白；(2)将biotin-dCas9-Halo功能化蛋白与sgRNA复合，制备得到CRISPR探针；(3)将CRISPR探针固定在BLI感受器上，制备得到CRISPR-BLI检测芯片。优选的，步骤(1)中，编码dCas9的基因序列如SEQIDNO.1所示；编码Halo标签的基因序列如SEQIDNO.2所示。优选的，步骤(1)中，对dCas9-Halo蛋白进行生物素定点修饰的方法为：用pH＝7.4的PBS缓冲液将dCas9-Halo蛋白超滤浓缩，使蛋白的终浓度大于或等于1mg/mL；向浓缩后的dCas9-Halo蛋白溶液中加入HaloTag@PGE-BiotinLigand母液，混匀，室温反应30-90分钟，以pH＝7.4的PBS缓冲液为流动相过除盐柱，除去未反应小分子，收集浓缩修饰后蛋白。优选的，步骤(2)中，biotin-dCas9-Halo功能化蛋白与sgRNA复合的方法为：将500μgbiotin-dCas9-Halo功能化蛋白超滤浓缩至500～1000μL；取100-250μL的sgRNA加入到浓缩后的biotin-dCas9-Halo溶液中，混合均匀，在37℃条件下孵育复合15-30分钟。优选的，步骤(3)中，将CRISPR探针固定在BLI感受器上的方法为：将BLI感受器首先浸入平衡液1中平衡基线60-120秒，然后浸入CRISPR探针溶液中500-900秒，将CRISPR探针固定在BLI感受器上；所述平衡液1为：含有5-50μg/ml肝素钠、0.1～0.01％BSA、0.01～0.05％TritonX-100、0.01～0.05％Tween-20、0.1～0.5mol/LNaCl、1～5mmol/LMgCl2、1～5mmol/mlEDTA和0.1～0.01％变性鲑鱼精DNA的0.1MPBS，pH＝6.0-8.0。本专利技术的第三方面，提供上述CRISPR-BLI检测芯片在如下(1)或(2)中的应用：(1)检测核酸；(2)制备检测核酸的产品。本专利技术的第四方面，提供一种利用上述CRISPR-BLI检测芯片检测核酸的方法，包括以下步骤：(1)将上述CRISPR-BLI检测芯片浸入1xPBS缓冲液中60-120秒，平衡BLI信号基线；(2)将步骤(1)平衡BLI信号基线后的CRISPR-BLI检测芯片浸入到系列浓度的DNA标准品中200-500秒，结合信号由BLI进行实时输出；(3)将步骤(2)处理后的CRISPR-BLI检测芯片浸入1xPBS缓冲液中200-500秒，使DNA标准品从CRISPR-BLI检测芯片上解离下来；(4)构建BLI响应信号与DNA标准品浓度之间的标准曲线，根据标准曲线对待测样品中的核酸进行检测。优选的，DNA标准品的序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术调取化脓链球菌(Streptococcuspyogene)的CRISPR/Cas9基因，利用基因重组和分子生物学方法得到具有Halo标签的核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CRISPR-BLI检测芯片，其特征在于，包括：BLI感受器和固定在BLI感受器上的CRISPR探针；/n所述CRISPR探针由biotin-dCas9-Halo功能化蛋白和sgRNA复合而成；所述biotin-dCas9-Halo功能化蛋白为dCas9-Halo蛋白经生物素定点修饰获得，dCas9-Halo蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR-BLI检测芯片，其特征在于，包括：BLI感受器和固定在BLI感受器上的CRISPR探针；
所述CRISPR探针由biotin-dCas9-Halo功能化蛋白和sgRNA复合而成；所述biotin-dCas9-Halo功能化蛋白为dCas9-Halo蛋白经生物素定点修饰获得，dCas9-Halo蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。


2.根据权利要求1所述的CRISPR-BLI检测芯片，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQIDNO.6所示。


3.权利要求1或2所述的CRISPR-BLI检测芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将编码dCas9和Halo标签的基因序列连接到表达载体上，获得重组表达质粒，并转化到大肠杆菌中进行原核表达，分离纯化得到dCas9-Halo蛋白；将dCas9-Halo蛋白进行生物素定点修饰，制备得到biotin-dCas9-Halo功能化蛋白；
(2)将biotin-dCas9-Halo功能化蛋白与sgRNA复合，制备得到CRISPR探针；
(3)将CRISPR探针固定在BLI感受器上，制备得到CRISPR-BLI检测芯片。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，编码dCas9的基因序列如SEQIDNO.1所示；编码Halo标签的基因序列如SEQIDNO.2所示。


5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，对dCas9-Halo蛋白进行生物素定点修饰的方法为：用pH＝7.4的PBS缓冲液将dCas9-Halo蛋白超滤浓缩，使蛋白的终浓度大于或等于1mg/mL；向浓缩后的dCas9-Halo蛋白溶液中加入HaloTag@PGE-BiotinLigand母液，混匀，室温反应30-90分钟，以pH＝7.4的PBS缓冲液为流动相过除盐柱，除去未反应小分子，收集浓缩修饰后蛋白。


6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，biotin-dCas9...

【专利技术属性】
技术研发人员：高玉舟，乔善鹏，李海超，刘珍妮，何欣，
申请(专利权)人：济南国科医工科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37