【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及dna水凝胶及生物传感器领域，特别涉及一种基于dna水凝胶的垂直纸基传感器及mirna检测方法。
技术介绍
1、目前检测mirna浓度的方法包括荧光定量pcr、微阵列芯片、比色法、电化学法、表面等离子共振和表面增强拉曼散射法等，尽管这些方法通常具有较高的灵敏度和优异的检测性能，但存在设备要求高、样品处理复杂、检测过程繁琐等问题。为了满足即时检测的需求，进一步简化检测程序、降低检测成本，基于距离分析的纸基传感器受到越来越多的关注。然而，目前的纸基传感装置多采用在纸基基底上蜡打印疏水图案来制备，通常需要一个较大的样品区和极细的检测区域。通过在检测区沉积比色试剂，耗尽反应物达到反应终点的方式进行信号生成和读取。这种方法存在预处理过程复杂、沉积不均匀、反应终点不清晰等问题，并且灵敏度和准确性难以达到较高的水平，从而限制了它的广泛应用。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于dna水凝胶的垂直纸基传感器及mirna检测方法。
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种基于dna水凝胶垂直纸基传感器的mirna检测方法，该方法为：将待测样本加入含有模板链和dna聚合酶、切刻内切酶的反应体系中，反应后再加入连接链l2和预先制备的y型dna，反应后所得产物溶液转移至样品池内，样品池上方设置有垂直布置的滤纸条，且滤纸下边缘接触样品池内液面，记录产物溶液在滤纸上流动上升的高度，然后根据预先构建的表征产物溶液在滤纸
3、其中，模板链在dna聚合酶的作用下形成双链，待测样本中的目标mirna能够与模板链上的互补序列结合，竞争性地释放出所形成的双链上的连接链l1，连接链l1与反应体系中的连接链l2链杂交形成不完全互补配对的双链dna，通过该dna的5’末端与3’末端单链区域与y型dna末端单链区域进行杂交，最终形成具有三维网络结构的dna水凝胶；该dna水凝胶的形成使反应体系的粘度提高，从而使得产物溶液在滤纸上流动上升的高度下降，且该高度的大小与待测样本中的目标mirna的浓度对数值呈线性关系。
4、优选的是，所述y型dna通过以下方法制备得到：将dna链a、dna链b、dna链c分别用tris-hcl缓冲液稀释制备成溶液，然后混合反应，反应结束后得到y型dna。
5、优选的是，其中，连接链l1上具有与连接链l2上的第一部分序列相同的序列以及与连接链l2上的第二部分序列互补的序列，l1、l2能杂交形成一段具有5’、3’黏性末端的双链dna；
6、dna链a由一段与l1、l2的黏性末端互补的序列、一段与dna链b互补的序列和一段与dna链c互补的序列组成，dna链b由一段与l1、l2的黏性末端互补的序列、一段与dna链c互补的序列和一段与dna链a互补的序列组成，dna链c由一段与l1、l2的黏性末端互补的序列、一段与dna链a互补的序列和一段与dna链b互补的序列组成；
7、dna链a、dna链b、dna链c杂交形成具有黏性末端的y型dna，一段l1、l2杂交形成的双链dna连接两个y型dna的黏性末端，而一个y型dna的三个黏性末端则分别与其他三个y型dna相连，最终形成dna水凝胶的三维网络结构。
8、优选的是，dna链a、dna链b、dna链c的序列依次如seq id no:1-3所示，连接链l1、连接链l2、模板链、目标mirna的序列依次如seq id no:4-7所示，具体如下：
9、seq id no:1：
10、cgattgactctccacgctgtcctaaccatgaccgtcgaag；
11、seq id no:2：
12、cgattgactctccttcgacggtcatgtactagatcagagg；
13、seq id no:3：
14、cgattgactctccctctgatctagtagttaggacagcgtg；
15、seq id no:4：
16、gagagtcaatcgtctattcgcatgagaattccattcaccgtaag
17、seq id no:5：
18、gagagtcaatcgcttacggtgaatggaattctcatgcgaataga
19、seq id no:6：
20、cttacggtgaatggaattcttgcgaatagacgattgactctcctcagcaactatacaacctactacctca
21、seq id no:7：
22、ugagguaguagguuguauaguu。
23、优选的是，所述y型dna通过以下方法制备得到：将dna链a、dna链b、dna链c分别用tris-hcl缓冲液稀释制备成浓度相同的溶液，然后等体积，95℃反应5min，然后在室温下反应2h，反应结束后得到y型dna。
24、优选的是，标准曲线的构建方法包括以下步骤：
25、配制一系列具有浓度梯度的目标mirna标准溶液，将标准溶液加入含有模板链和dna聚合酶、切刻内切酶的反应体系中，反应后再加入连接链l2和预先制备的y型dna，反应后所得产物溶液转移至样品池内，记录时间t内，产物溶液在滤纸上流动上升的高度，然后以目标mirna的浓度对数值作为横坐标、高度作为纵坐标，拟合得到标准曲线。
26、优选的是，将待测样本加入含有模板链、dna聚合酶、切刻内切酶的反应体系中，反应60-120min后再加入连接链l2和预先制备的y型dna，37℃下反应30-90min，所得产物溶液转移至样品池内，记录时间t内产物溶液在滤纸上流动上升的高度，然后根据标准曲线计算得到待测样本中的目标mirna浓度。
27、优选的是，标准曲线的构建方法包括以下步骤：
28、配制一系列具有浓度梯度的目标mirna标准溶液，将标准溶液加入含有模板链、dna聚合酶、切刻内切酶的反应体系中，反应60-120min后再加入连接链l2和预先制备的y型dna，37℃下反应30-90min，所得产物溶液转移至样品池内，记录时间t内，产物溶液在滤纸上流动上升的高度，然后以目标mirna的浓度对数值作为横坐标、高度作为纵坐标，拟合得到标准曲线。
29、优选的是，所述的基于dna水凝胶垂直纸基传感器的mirna检测方法为：将待测样本与模板链混合，然后加入klenow片段和nb.bbvci切刻内切酶，反应90min后，加入连接链l2和预先制备的y型dna，37℃下反应60min，所得产物溶液转移至样品池内，记录10min内产物溶液在滤纸上流动上升的高度，然后根据标准曲线计算得到待测样本中的目标mirna浓度。
30、本专利技术还提供一种基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于DNA水凝胶垂直纸基传感器的miRNA检测方法，其特征在于，该方法为：将待测样本加入含有模板链和DNA聚合酶、切刻内切酶的反应体系中，反应后再加入连接链L2和预先制备的Y型DNA，反应后所得产物溶液转移至样品池内，样品池上方设置有垂直布置的滤纸条，且滤纸下边缘接触样品池内液面，记录产物溶液在滤纸上流动上升的高度，然后根据预先构建的表征产物溶液在滤纸上流动上升高度与目标miRNA浓度之间关系的标准曲线计算得到待测样本中的目标miRNA浓度；
2.根据权利要求1所述的基于DNA水凝胶垂直纸基传感器的miRNA检测方法，其特征在于，所述Y型DNA通过以下方法制备得到：将DNA链A、DNA链B、DNA链C分别用Tris-HCl缓冲液稀释制备成溶液，然后混合反应，反应结束后得到Y型DNA。
3.根据权利要求2所述的基于DNA水凝胶垂直纸基传感器的miRNA检测方法，其特征在于，其中，连接链L1上具有与连接链L2上的第一部分序列相同的序列以及与连接链L2上的第二部分序列互补的序列，L1、L2能杂交形成一段具有5’、3’黏性末端的双链DNA；
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5.根据权利要求2所述的基于DNA水凝胶垂直纸基传感器的miRNA检测方法，其特征在于，所述Y型DNA通过以下方法制备得到：将DNA链A、DNA链B、DNA链C分别用Tris-HCl缓冲液稀释制备成浓度相同的溶液，然后等体积，95℃反应5min，然后在室温下反应2h，反应结束后得到Y型DNA。
6.根据权利要求1所述的基于DNA水凝胶垂直纸基传感器的miRNA检测方法，其特征在于，标准曲线的构建方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的基于DNA水凝胶垂直纸基传感器的miRNA检测方法，其特征在于，将待测样本加入含有模板链、DNA聚合酶、切刻内切酶的反应体系中，反应60-120min后再加入连接链L2和预先制备的Y型DNA，37℃下反应30-90min，所得产物溶液转移至样品池内，记录时间t内产物溶液在滤纸上流动上升的高度，然后根据标准曲线计算得到待测样本中的目标miRNA浓度。
8.根据权利要求6所述的基于DNA水凝胶垂直纸基传感器的miRNA检测方法，其特征在于，标准曲线的构建方法包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的基于DNA水凝胶垂直纸基传感器的miRNA检测方法，其特征在于，该方法为：将待测样本与模板链混合，然后加入Klenow片段和Nb.BbvCI切刻内切酶，反应90min后，加入连接链L2和预先制备的Y型DNA，37℃下反应60min，所得产物溶液转移至样品池内，记录10min内产物溶液在滤纸上流动上升的高度，然后根据标准曲线计算得到待测样本中的目标miRNA浓度。
10.一种基于DNA水凝胶的垂直纸基传感器，其特征在于，其包括滤纸和反应检测液，所述反应检测液包括如权利要求1-9中任意一项所述的模板链、连接链L2、Y型DNA、DNA聚合酶和切刻内切酶；该传感器采用如权利要求1-9中任意一项所述的方法进行miRNA的检测。
...【技术特征摘要】
1.一种基于dna水凝胶垂直纸基传感器的mirna检测方法，其特征在于，该方法为：将待测样本加入含有模板链和dna聚合酶、切刻内切酶的反应体系中，反应后再加入连接链l2和预先制备的y型dna，反应后所得产物溶液转移至样品池内，样品池上方设置有垂直布置的滤纸条，且滤纸下边缘接触样品池内液面，记录产物溶液在滤纸上流动上升的高度，然后根据预先构建的表征产物溶液在滤纸上流动上升高度与目标mirna浓度之间关系的标准曲线计算得到待测样本中的目标mirna浓度；
2.根据权利要求1所述的基于dna水凝胶垂直纸基传感器的mirna检测方法，其特征在于，所述y型dna通过以下方法制备得到：将dna链a、dna链b、dna链c分别用tris-hcl缓冲液稀释制备成溶液，然后混合反应，反应结束后得到y型dna。
3.根据权利要求2所述的基于dna水凝胶垂直纸基传感器的mirna检测方法，其特征在于，其中，连接链l1上具有与连接链l2上的第一部分序列相同的序列以及与连接链l2上的第二部分序列互补的序列，l1、l2能杂交形成一段具有5’、3’黏性末端的双链dna；
4.根据权利要求3所述的基于dna水凝胶垂直纸基传感器的mirna检测方法，其特征在于，dna链a、dna链b、dna链c的序列依次如seq id no:1-3所示，连接链l1、连接链l2、模板链、目标mirna的序列依次如seq id no:4-7所示。
5.根据权利要求2所述的基于dna水凝胶垂直纸基传感器的mirna检测方法，其特征在于，所述y型dna通过以下方法制备得到：将dna链a、dna链b、dna链c分别用tris-hcl...
【专利技术属性】
技术研发人员：缪鹏，严承宇，陈锡峰，柴华，
申请(专利权)人：济南国科医工科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：
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