一类抑制草地贪夜蛾取食的白细胞激肽及其类似物制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一类具有抑制昆虫取食作用的激肽及其类似物。本发明专利技术基于生物信息学技术克隆了草地贪夜蛾白细胞激肽基因；并分析预测其成熟肽序列；随后合成成熟肽并进行改造修饰获得成熟肽类似物；然后利用注射的方式将成熟肽及其类似物注射到草地贪夜蛾体内；最后对草地贪夜蛾取食量进行测定。取食量测定表明本发明专利技术可以较为显著抑制草地贪夜蛾取食，这为进一步开发安全、高效、绿色的新型多肽类害虫取食抑制剂提供帮助。

【技术实现步骤摘要】
一类抑制草地贪夜蛾取食的白细胞激肽及其类似物一、
本专利技术涉及生物
，具体涉及一类具有抑制昆虫取食效果的激肽及其类似物。二、技术背景昆虫神经肽是昆虫脑内神经细胞周期性合成、分泌并传递的一类小分子活性多肽，通常由2～10个氨基酸构成，是一类重要的化学信使。1917年，Kopec通过对舞毒蛾进行的实验，提出了关于内激素的假设，而在1926年，Kopec等首次发现昆虫大脑中的分泌物能够控制昆虫的取食行为，这是科学家首次对昆虫神经肽的认识和研究。而第一次分离出神经肽则是1975年对直肠素(proctolin)的分离。随后脂动激素(adipokinetichormone)的结构也被解析出来，这两种肽均为10个氨基酸以内的短肽。在这之后，随着现代生物化学、生物物理学、分子生物学、分析测试及基因工程技术的发展和应用，一系列重要的昆虫神经肽被分离、纯化，大量的一级结构被确定。目前的研究表明，昆虫神经肽控制和调节着昆虫体内器官或腺体的活动，进而影响昆虫的生长、发育、变态、生殖和代谢等重要的生理过程，且多数昆虫神经肽受体是G蛋白偶联受体(GPCR)，因此研究昆虫激肽及其类似物与受体的相互作用可帮助发现新的杀虫剂作用靶标并对新型杀虫剂的研发具有重要指导意义。白细胞激肽(Leucokinins，LKs)广泛存在于无脊椎动物尤其是昆虫的神经系统中，最早在马德拉蜚蠊(Leucophaeamaderae)体内被发现。后来不断地从各种昆虫体内分离出来，其中又以双翅目、鳞翅目和直翅目的昆虫为多，再后来从线虫动物和软体动物中也分离出了类似的激肽。LKs一般由7-15个氨基酸构成，具有C末端五肽序列FX1X2WG，其中X1＝F、H、N、S或Y，X2＝A、P或S。Nachman和Holman等人发现，这种五肽片段是LKs保持生物活性所需的最短序列，是LKs的主要功能区，称为“活性核心”。研究表明LKs在利尿、消化器官收缩和幼虫发育等关键过程中起到重要作用，而其在昆虫取食方面的抑制作用则是最有应用价值、最有可能被开发为新型杀虫剂的。此类多肽及类似物在取食方面的重要作用已经在很多研究被证明，例如人工施加外源白细胞激肽可以抑制烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)幼虫的体重增长，注射白细胞激肽则会率引起蚜虫拒食并死亡等。LKs一般是通过改变昆虫肠道运动模式、抑制消化酶释放、阻断体液循环及营养转运等方式使昆虫消化过程紊乱，导致食物在肠道中堆积，从而起到抑制昆虫取食的作用，最终引起昆虫死亡。不过LKs易被特异性的酶降解，生物稳定性较低，这大大降低了其实用价值。因此需要对其进行修饰和改造，以提高其生物稳定性。Nachmn等人发现当C端五肽类似物中位于酶解位点的Ser被非天然氨基酸[Aib]替换后，抗昆虫ACE酶降解能力明显增强。这种通过关键氨基酸残基替换的修饰方式也为后续LKs类似物的开发提供了思路。草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)属于鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)。原产于美洲热带和亚热带地区，具有远距离迁飞习性，是一种重要的农业害虫。其食谱范围大，寄主植物高达353种，主要包括禾本科的玉米、水稻以及棉花、甜菜等多种作物。草地贪夜蛾对不同寄主有偏好性，也因为这种偏好性逐渐分化形出了玉米型和水稻型两个亚型。2016年起，草地贪夜蛾开始入侵至非洲、亚洲各国，并于2019年由缅甸入侵我国云南西部地区，并随后波及了19个省份。主要为害我国的冬玉米，已在我国造成巨大的农业损失。目前田间主要是通过化学农药来对其进行防治，然而因害虫抗药性的不断提高使得农药的使用剂量随之加大，而农药剂量的增加则引发了农产品质量安全、环境安全和生物多样性等一系列问题，所以亟需研发出具有新型作用机制，且对环境污染小的安全、高效的新型杀虫剂以及新的杀虫作用靶点。本专利技术借助生物信息学技术克隆了草地贪夜蛾白细胞激肽基因；并分析预测了其成熟肽序列；随后通过对成熟肽的修饰改造获得了具有显著抑制害虫取食作用的激肽类似物。三、
技术实现思路
专利技术目的本专利技术的目的在于提供一类具有抑制昆虫取食作用的激肽及其类似物，为进一步开发抑制害虫取食的新型杀虫剂以及新型杀虫剂作用靶标的研发提供帮助。技术方案以室内饲养的草地贪夜蛾为对象，经过基因克隆技术克隆得到草地贪夜蛾白细胞激肽Sflk基因序列，并分析预测其成熟肽序列，对其成熟肽序列进行修饰改造，然后进行合成，分别得到以下四种序列：Sfkinin-2：VRFSPWGa、Sfkinin-3：KVKFSAWGa、SfLKanalogs-1：[Aib]FS[Aib]WGa、SfLKanalogs-2：Ac-R[β3F]FS[Aib]WGa。再利用注射的方式将成熟肽及其类似物递送至草地贪夜蛾体内，最后对草地贪夜蛾进行取食行为测定，明确其对害虫取食的抑制效果。有益效果本专利技术专利技术所提供的的几种白细胞激肽类似物，相较于昆虫体内生物源的天然多肽来讲，其生物稳定性更高，抑制取食的效果更显著。可以为进一步开发安全、高效、绿色的新型多肽类害虫取食抑制剂提供帮助。附图说明图1Sflk基因编码的三种成熟肽。图2两种成熟肽及其类似物的分子结构图。图3注射白细胞激肽成熟肽及其类似物对草地贪夜蛾取食量的影响。具体实施方式以下所述的试验操作便于更好的理解本专利技术，但不限定本专利技术。下述内容中所用试验材料与方法，如无特殊说明，均为常规材料和方法。1.Sflk基因克隆及类似物合成(1)Sflk基因克隆以本实验室所测得草地贪夜蛾转录组数据为基础，通过Nr，Nt，Pfam，KOG/COG，Swiss-prot，KEGG，GO七大数据库对所测得转录本进行注释，获得所有可能的Sflk基因。将获得的基因利用SeqMan软件进行拼接，拼接后的序列利用Blastx分析，确定Sflk的基因序列。然后利用EditSeq软件预测此序列中编码白细胞激肽的开放阅读框(ORF)，即蛋白质编码区(CDS)，利用NCBI在线引物设计工具设计引物，对此序列进行克隆验证。全长克隆引物SF-lk-F80：GCAGTGATCGAATTACAAAAGAACCSF-lk-R1153：AAGTTCGGGAGCAAAACATCG克隆验证具体实验操作如下：取草地贪夜蛾四龄幼虫一头加入1mlTRIzolreagent(Invitrogen)，匀浆仪匀浆处理4min，匀浆样品在室温放置5min后，涡旋震荡使核酸蛋白复合物完全分离，利用RNA抽提试剂盒提取总RNA，所提取的RNA直接用于反转录或者置于-70℃冰箱备用。总RNA提取后，按照IIQRTSuperMixforqPCR(+gDNAwiper)试剂盒(Vazyme，Nanjing，China)的说明，以500ng总RNA为模板，在10μl的反应体系中合成cDNA。合成的cDNA模板直接用于基因克隆或者置于-20℃冰箱保存备用。使用Vazyme公司的高保真酶2×PhantaMaste本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一类昆虫激肽及其类似物，其特征在于，所述激肽为白细胞激肽，所述类似物为白细胞激肽基础上修饰获得。/n

【技术特征摘要】
1.一类昆虫激肽及其类似物，其特征在于，所述激肽为白细胞激肽，所述类似物为白细胞激肽基础上修饰获得。


2.一类昆虫激肽类及其似物，其特征在于，所述类似物的序列为








Sfkinin-2
VRFSPWGamide


Sfkinin-3
KVKFSAWGmide


SfLKanalo...

【专利技术属性】
技术研发人员：马俊宇，吴顺凡，高聪芬，郭迪，张晓燕，王美桐，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32