噬菌体展示技术筛选可穿越血-脑脊液屏障的多肽制造技术

本发明专利技术公开了一种噬菌体展示技术筛选可穿越血‑脑脊液屏障的多肽，它涉及蛋白质多肽技术领域。本发明专利技术的生物活性肽能经血液循环跨越血‑脑脊液屏障，渗入脑脊液并在脑脊液中富集。本发明专利技术涉及一种通过噬菌体展示技术获得跨越血‑脑脊液屏障的肽的方法。所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1‑4所示，分别为CMRTHHMQC、CMWTHHYQC、CMRTHHYQC、CMWTHHMQC。利用本发明专利技术所述的肽构建具有靶向性的药物载体，从而使药物载体于脑脊液中富集，可用于脑部疾病的诊断及治疗。

【技术实现步骤摘要】
噬菌体展示技术筛选可穿越血-脑脊液屏障的多肽
本专利技术涉及的是蛋白质多肽
，具体涉及一种噬菌体展示技术筛选可穿越血-脑脊液屏障的多肽。
技术介绍
随着人类社会老龄化问题日趋严重，脑部疾病的发病率正呈现递增趋势，脑部疾病尤其是中枢系统疾病正威胁人类的生命与健康。通常情况下脑部疾病指颅内组织器官（脑膜血管、大脑、小脑、脑干、颅神经等）的炎症、血管病、肿瘤、变性、畸形、遗传病、免疫性疾病、营养代谢性疾病、中毒、外伤、寄生虫病等的总称。病情各异，有的还直接危及生命。常表现意识、感觉、运动等障碍或植物神经功能障碍。亦可有发热、头痛、呕吐等症状及精神症状。血-脑屏障(BBB)是血液与神经实质的调节界面，不仅有被动机械性保护屏障作用，且能有选择性地将脑内过剩物质泵出脑外，调节中枢神经系统的生理平衡，保持脑的内环境恒定。以往研究表明，BBB的结构基础是脑毛细血管内皮细胞与脉络丛上皮。脑毛细血管内皮细胞膜上有其独特的酶系统，脉络丛也具有主动转运的酶系统。能使某些药物降解，这些酶从而构成BBB的酶屏障，阻止相应的底物入脑，对BBB的通透性具有不可忽视的作用。如多巴胺脱羧酶能使L-多巴和L-5-羟色胺酸脱羧生成不易透过BBB的L-多巴胺和L-5-羟色胺，使用单胺氧化酶抑制剂后方能透过BBB；脑毛细血管内皮细胞膜上的P-糖蛋白等有外排泵的作用，它能选择性地将脑内有害物质或过剩物质泵出脑外，并限制某些物质在脑内递送。血脑屏障的酶屏障及外排泵的结构与功能对脑组织相对内环境恒定的维持起到一定的作用，但在对脑疾病治疗中限制了药物进入脑内。据相关统计，由于血脑屏障的存在，目前临床常规制剂用药后，大约有98％的化学药物和几乎100％的蛋白多肽或基因药物难以入脑，这极大程度限制了对脑部疾病的治疗。血脑脊液屏障（BCSFB）是位于血管系统和中枢神经系统之间的选择性调节界面，这个调节界面可以通过调节大脑的化学环境、免疫细胞的运输等来维持大脑环境的稳态，同时血脑脊液屏障也可以处置外来物质。血脑脊液屏障是由中枢神经系统（CNS）毛细血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞和神经元共同组成的一种功能性的细胞复合体。其中内皮细胞能够形成控制药物、外源性物质、内源性肽和其它化合物转运的物理屏障。脉络丛的毛细血管内皮细胞上有窗孔，因此血-脑脊液屏障与血脑屏障相比具有一定的通透性，为药物入脑发挥疗效提供了可能。目前已有通过物理或化学方法短暂性开放血-脑脊液屏障来增加药物入脑可能性，但该方法是侵入性和非靶向性的，并且会增加大量潜在的神经毒素和其他化学物质进入脑内的风险，不利于中枢神经系统的稳态且使产生不良副作用的可能性增大。相比之下，纳米载体，例如脂质体和纳米粒，具有很好的靶向选择性。已经有越来越多可选择的纳米粒和脂质体种类用于治疗。经表面修饰后的脂质体或纳米粒，可以通过特定的机制靶向中枢神经系统。筛选可以跨越血-脑脊液屏障的肽，提高药物精确的选择性，以达到更好的治疗效果，降低药物所导致的全身毒性。噬菌体展示肽库技术是利用基因工程手段将外源基因片段插入噬菌体特定蛋白基因,通过噬菌体表达外源基因编码的蛋白或多肽,保持重组融合蛋白的相对空间结构和生物学活性并呈现于噬菌体表面，经生物淘洗去除非靶向结合的噬菌体，通过3-5轮收集、扩增及富集获得高亲和力、高特异性的噬菌体单克隆，采用基因测序鉴定这些噬菌体克隆编码的蛋白序列可用于进一步研究。有研究通过噬菌体展示技术筛选出与内皮细胞特异性结合的多肽，其中最具代表性的是可与肿瘤血管内皮细胞特异结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列，筛选出的RGD于纳米载体结合形成的长循环纳米载药系统对肿瘤细胞表现出良好的靶向性。Barati等获得HER2来源多肽AE37，同时将AE37与λ噬菌体外壳蛋白gpD构建新型纳米颗粒融合肽且能够产生有效预防和治疗HER2阳性乳腺癌。研究显示，抗体噬菌体展示库获得的初始抗体通常亲和力较低，通过重组突变增加多样性并经亲和力筛选可获得高亲和力的单克隆抗体。与本专利技术相关的现有技术还有：JingweiLi,LiangFeng,XinguoJiang.Invivophagedisplayscreenforpeptidesequencesthatcrosstheblood–cerebrospinal-fluidbarrier.201547(2):401-405.JingweiLi,QizhiZhang,ZhiqingPang,etal.Identificationofpeptidesequencesthattargettothebrainusinginvivophagedisplay.201242(6):2373-2381.AkinoriWada,TomoyaTerashima,SusumuKageyama,etal.EfficientProstateCancerTherapywithTissue-SpecificHomingPeptidesIdentifiedbyAdvancedPhageDisplayTechnology.201912:138-146.。综上所述，本专利技术设计了一种噬菌体展示技术筛选可穿越血-脑脊液屏障的多肽。
技术实现思路
针对现有技术上存在的不足，本专利技术目的是在于提供一种噬菌体展示技术筛选可穿越血-脑脊液屏障的多肽，为了实现上述目的，本专利技术是通过如下的技术方案来实现：噬菌体展示技术筛选可穿越血-脑脊液屏障的多肽，所述的多肽是经噬菌体展示七肽库(Ph.D.-C7CTMPhagedisplaypeptidelibrary)，筛选出的能跨越血-脑脊液屏障的多肽序列。所述的多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1-4所示，分别为CMRTHHMQC、CMWTHHYQC、CMRTHHYQC、CMWTHHMQC。所述的噬菌体展示技术筛选可穿越血-脑脊液屏障的多肽的方法如下：a)静脉给予噬菌体随机展示肽库，随后从脑脊液中回收噬菌体；将回收噬菌体进行扩增，重复a)的步骤，直至获得能跨越血-脑脊液屏障的共有肽序列。所述的噬菌体展示技术筛选可穿越血-脑脊液屏障的多肽在靶向制剂中的应用；所述靶向制剂如，载药纳米粒、脂质体、泡囊或胶束等。基于上述纳米粒、脂质体、泡囊或胶束的表面进行多肽修饰，从而获得本专利技术所述肽的靶向制剂。利用静电吸附、亲和连接或共价连接等方法在上述制剂表面进行多肽修饰。所述的噬菌体展示技术筛选可穿越血-脑脊液屏障的多肽在治疗神经变性病症，优选阿尔茨海默病上的应用，所述的噬菌体展示技术筛选可穿越血-脑脊液屏障的多肽用于缺氧缺血性脑损伤和中风后抑郁症等脑部疾病。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术筛选得到的多肽具有相对分子质量小、稳定性佳、活性好、生物穿透力强、亲和力与特异性高、毒性低等优点。2、本专利技术筛选得到的多肽可以用于脑部靶向性的药物载体系统的构建。附图说明下面结合附图和具体实施方式来详细说明本专利技术；图1为本专利技术单克隆噬菌体的入脑验证示意图；图2为本专利技术的Pep-1肽动物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.噬菌体展示技术筛选可穿越血-脑脊液屏障的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1-4所示，分别为CMRTHHMQC、CMWTHHYQC、CMRTHHYQC、CMWTHHMQC。/n

【技术特征摘要】
1.噬菌体展示技术筛选可穿越血-脑脊液屏障的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1-4所示，分别为CMRTHHMQC、CMWTHHYQC、CMRTHHYQC、CMWTHHMQC。


2.根据权利要求1所述的噬菌体展示技术筛选可穿越血-脑脊液屏障的多肽，其特征在于，所述多肽用于治疗神经变性病...

【专利技术属性】
技术研发人员：李婧炜，李永杰，杨茜，
申请(专利权)人：李婧炜，
类型：发明
国别省市：云南;53