一种萃取-反萃取分离纯化surfactin方法技术

本发明专利技术涉及生物化工技术领域，尤其是一种萃取‑反萃取分离纯化surfactin方法，利用surfactin发酵液的酸沉物，加入醇溶液振荡或超声10min后，过滤，得醇过滤液；醇过滤液与正己烷、乙酸乙酯、水构建萃取体系a，调pH为1.5‑4萃取，分层，取上层有机相；另将正己烷、乙酸乙酯、水和醇混合构建萃取体系b，静置分层，取下层，获得萃取体系b下层水相；将上层有机相与萃取体系b下层水相按体积比1:1混合，调节pH为7‑8，振荡，静置分层，取下层水相冷冻干燥后，即得surfactin纯化物，充分利用了surfactin酸性条件下不溶于水，但易溶于复配有机溶剂，且中性条件下易溶于水，但不溶于复配有机溶剂的特性，使得纯化物中，surfactin含量≥65％。

【技术实现步骤摘要】
一种萃取-反萃取分离纯化surfactin方法
本专利技术涉及生物化工
，尤其是一种萃取-反萃取分离纯化surfactin方法。
技术介绍
Surfactin是由7个氨基酸残基组成的环肽和13-15个碳原子链长的β-羟基脂肪酸酯化而成，于1968年被Arima等首次从枯草芽孢杆菌中分离出来。经研究表面：Surfactin在抗菌、抗病毒、抗癌、溶血栓等方面表面出极好的生物活性，在化妆品、医药、食品、乳化剂、保湿剂、精细化工等行业具有广泛的应用前景。可是，目前市场上Surfactin的商品价格昂贵，Surfactin标准品的价格超过200元/mg，究其原因，主要体现在：①现有Surfactin生产主要依靠生物发酵，发酵生产的产量极低，致使生物发酵产物中的Surfactin含量低，维持在mg-g/L的水准；②Surfactin为小分子脂肽化合物，与培养基的杂质成分类似，分离纯化困难。经查阅相关研究文献，发现有许多集中在环脂抗菌肽分离提纯的研究，但是未注重对分离物中Surfactin的含量提升，以便于后续进一步精制研究，例如：刘佳欣等.枯草芽孢杆菌HS-A38产抗菌脂肽BacillomycinD的组分分析与鉴定[J].工业微生物，2017年04月，第47卷第2期，公开了将HS-A38发酵液离心分离上清液，酸沉淀、醇抽提、甲醇溶液减压旋蒸，获得固态粗提物，得出粗提物棕黄色粉末，产率1.956g/L，然而，该研究并未公开最终提取物surfactin的含量。再例如：林青荣.枯草芽孢杆菌脂肽类物质的分离纯化鉴定与应用研究[D].山西大学，2012：12-15，公开了将发酵液在8000r/min条件下离心20min除去菌体，得到上清液，再从上清液中提取脂肽类物质：①甲醇直接抽提，静置12h；②乙醇直接抽提，静置12h(同甲醇，)；③6mol/L盐酸调pH沉淀，离心收集沉淀，除去水分，加入甲醇萃取，搅拌，滤去沉淀，得甲醇提取液；④6mol/L盐酸调pH沉淀，离心收集沉淀，除去水分，加入乙醇抽提沉淀。再将①、②、③、④处理中所得的溶液加入适量蒸馏水，调整pH至7.0,50℃旋转蒸发除去有机溶剂，得到黄色粉末样品，采用正己烷洗涤三次，除去游离脂肪酸，得样品；得出：第③组提取脂肽获得量达到最优，利用标样，HPLC测定脂肽提取的平均回收率为91.65％，该研究也未公开提取物中surfactin的含量。除上述缺陷之外，现有研究中的分离提纯手段，主要采用的是：酸沉淀、吸附分离、膜过滤、絮凝、色谱分离等，但这些分离纯化方法存在着诸多问题：①所得产品中Surfactin含量不高，例如酸沉淀；②所得产品的成本高昂，工艺要求高，例如：膜过滤、超滤等；③仅适用于试验室小批量生产，不适合大规模工业化操作，例如色谱分离；④带来新的杂质，影响后续精制工艺，例如絮凝，带入絮凝剂杂质等。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本专利技术提供一种萃取-反萃取分离纯化surfactin方法，利用surfactin酸性条件下不溶于水，但易溶于复配有机溶剂，且中性条件下易溶于水，但不溶于复配有机溶剂的特性，实现萃取-反萃取工艺分离纯化surfactin，此专利技术适宜工业化纯化surfactin，为后面进一步精制surfactin提供条件，步骤简单，耗能低，设备要求低，且降低废液排放量，不消耗大量酸碱，可实现有机溶剂循环利用，降低surfactin产品分离纯化成本。具体是通过以下技术方案得以实现的：本专利技术创造的目的之一在于提供萃取-反萃取分离纯化surfactin方法，包括以下步骤：(1)将含surfactin发酵液离心除菌，得到上清液；向上清液中加入酸，固液分离收集沉淀，得酸沉物；(2)向酸沉物中加入甲醇或乙醇，振荡或超声10min，过滤，得醇过滤液；(3)将醇过滤液与正己烷、乙酸乙酯、水混合构建萃取体系a，调节萃取体系a的pH为1.5-4，振荡，静置分层，取上层有机相；(4)将正己烷、乙酸乙酯、水和醇混合构建萃取体系b，静置分层，取下层，获得萃取体系b下层水相；(5)将步骤(3)中的上层有机相与步骤(4)中的萃取体系b下层水相按体积比1:1混合，调节pH为7-8，振荡，静置分层，取下层水相；冷冻干燥，即得含量≥65％的surfactin纯化物。优选，所述的萃取体系a和所述萃取体系b均是以正己烷、乙酸乙酯、醇和水按照体积比为1:1:1:1或6:1:6:1或1:2:1:1混合而成。更优选，所述的萃取体系a和所述萃取体系b均是以正己烷、乙酸乙酯、醇和水按照体积比为1:1:1:1，在该配合比下，一是能够起到更好的分层效果，二是surfactin在酸性下易溶于有机相、不溶于水相，中性条件下易溶于水相，不溶于有机相，保障了分离纯化效果，提高萃取、反萃取的回收率。优选，所述的醇为甲醇或乙醇。优选，所述的步骤(3)，调节pH为2。优选，所述的步骤(4)，调节pH为7。优选，所述的步骤(3)，所述萃取体系a的温度为40-50℃；和/或所述步骤(4)，所述萃取体系b的温度为40-50℃。能够解决乳化效应，防止萃取体系发生乳化，保障萃取和反萃取的效果，有助于提高回收率和纯度。本专利技术创造的目的之二在于提供上述的萃取-反萃取分离纯化surfactin方法制备的含surfactin的纯化物，所述纯化物中surfactin含量≥65％。本专利技术创造的目的之三在于提供一种萃取-反萃取分离纯化surfactin方法用萃取体系，以正己烷、乙酸乙酯、醇和水按照体积比为1:1:1:1或6:1:6:1或1:2:1:1混合而成。该萃取体系能够经过调节pH值，使得pH值在酸性时，将surfactin萃取至有机相层，pH值在中性时，将surfactin反萃取至水相层，实现分离纯化surfactin的目的，且能够使得纯化物中surfactin含量≥65％。与现有技术相比，本专利技术创造的技术效果体现在：①适用于液态发酵的surfactin分离纯化，也适合与固态发酵生产的surfactin分离纯化。②醇过滤液与正己烷、乙酸乙酯、水构建萃取体系a，调pH为1.5-4萃取，分层，取上层有机相；另将正己烷、乙酸乙酯、水和醇混合构建萃取体系b，静置分层，取下层，获得萃取体系b下层水相；将上层有机相与萃取体系b下层水相按体积比1:1混合，调节pH为7-8，振荡，静置分层，取下层水相冷冻干燥后，即得surfactin纯化物，充分利用了surfactin酸性条件下不溶于水，但易溶于复配有机溶剂，且中性条件下易溶于水，但不溶于复配有机溶剂的特性，使得纯化物中，surfactin含量≥65％。③纯化surfactin步骤简单，发酵液酸沉物，仅仅通过液液萃取、反萃取操作，可得到含量达到65％以上的surfactin，且surfactin回收率达到90％以上，为surfactin后续进一步精制提供了条件，适用于工业生产。④本专利技术采用简单的萃取-反萃取技术，因为是对发酵液酸沉物进行萃取-反萃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种萃取-反萃取分离纯化surfactin方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)将含surfactin发酵液离心除菌，得到上清液；向上清液中加入酸，固液分离收集沉淀，得酸沉物；/n(2)向酸沉物中加入甲醇或乙醇，振荡或超声10min，过滤，得醇过滤液；/n(3)将醇过滤液与正己烷、乙酸乙酯、水混合构建萃取体系a，调节萃取体系a的pH为1.5-4，振荡，静置分层，取上层有机相；/n(4)将正己烷、乙酸乙酯、水和醇混合构建萃取体系b，静置分层，取下层，获得萃取体系b下层水相；/n(5)将步骤(3)中的上层有机相与步骤(4)中的萃取体系b下层水相按体积比1:1混合，调节pH为7-8，振荡，静置分层，取下层水相，冷冻干燥，即得含量≥65％的surfactin纯化物。/n

【技术特征摘要】
1.一种萃取-反萃取分离纯化surfactin方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将含surfactin发酵液离心除菌，得到上清液；向上清液中加入酸，固液分离收集沉淀，得酸沉物；
(2)向酸沉物中加入甲醇或乙醇，振荡或超声10min，过滤，得醇过滤液；
(3)将醇过滤液与正己烷、乙酸乙酯、水混合构建萃取体系a，调节萃取体系a的pH为1.5-4，振荡，静置分层，取上层有机相；
(4)将正己烷、乙酸乙酯、水和醇混合构建萃取体系b，静置分层，取下层，获得萃取体系b下层水相；
(5)将步骤(3)中的上层有机相与步骤(4)中的萃取体系b下层水相按体积比1:1混合，调节pH为7-8，振荡，静置分层，取下层水相，冷冻干燥，即得含量≥65％的surfactin纯化物。


2.如权利要求1所述的萃取-反萃取分离纯化surfactin方法，其特征在于，所述的萃取体系a和所述萃取体系b均是以正己烷、乙酸乙酯、醇和水按照体积比为1:1:1:1或6:1:6:1或1:2:1:1混合而成。


3.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡美忠，陈敏，邬小兰，郁建生，张华琦，
申请(专利权)人：铜仁职业技术学院，
类型：发明
国别省市：贵州;52