一种家用型检测芹菜过敏原的高灵敏试剂盒、其检测方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种家用型检测芹菜过敏原的高灵敏试剂盒、其检测方法和应用，所述高灵敏试剂盒包括：试纸条：NC膜上的检测线上包被鼠抗芹菜单克隆抗体1，浓度为0.1～0.5mg/ml，质控线上包被羊抗小鼠IgG，浓度为2～8mg/ml；试纸条由上至下为吸水纸、NC膜，样品垫，固定于PVC胶板上；其中，吸水纸和样品垫与NC膜重叠部分为2mm；金标微孔：将芹菜金标抗体与冻干稀释液的混合液加入到低吸附酶标板的微孔后进行冻干得到；其中，所述芹菜金标抗体是用链霉亲和素金标复合物和生物素标记牛血清白蛋白金标复合物组成的网状结构来标记生物素化芹菜抗体2而制备得到。本发明专利技术的检测试剂盒，使用便利，检测灵敏度高，特异性强，极大地提高了家庭检测芹菜过敏原的便捷性。

【技术实现步骤摘要】
一种家用型检测芹菜过敏原的高灵敏试剂盒、其检测方法和应用
本专利技术涉及过敏原检测方法
，尤其涉及一种家用型检测芹菜过敏原的高灵敏试剂盒、其检测方法和应用。
技术介绍
食物过敏也称为食物变态反应或消化系统变态反应、过敏性胃肠炎，是由于某种食物或食品添加剂等引起的IgE介导和非IgE介导的免疫反应，而导致消化系统内或全身性的变态反应。在我国患有过敏性疾病的人高达两亿之多，而其中90％左右是由食品过敏引起的。芹菜作为一种常见蔬菜，属于八大类致敏原之一，它能引起严重的过敏反应，严重威胁着芹菜过敏人群的生命健康。目前国内外对芹菜过敏性疾病没有彻底有效的根治方法，防止芹菜过敏的最有效手段是避免食入含有芹菜的食物。目前芹菜过敏原检测方法主要有电泳法、色谱法、酶联免疫实验(ELISA)、生物免疫传感器、基于质谱的蛋白质组学(LC-MS/MS)和聚合酶链式反应技术(PCR)等。其中，电泳法、色谱法和酶联免疫实验法是基于蛋白的传统的芹菜检测方法，往往只能针对单个蛋白进行分析，虽然发展的较为成熟但尚不能满足需求；基于质谱的蛋白质组学，可以同时高通量、高灵敏度的快速检测多种食物过敏原。聚合酶链式反应技术(PCR)是以DNA/RNA为基础发展起来的一项检测技术，经高温变性、低温退火及中温延伸等三步环节组成一个循环周期，达到目的基因特异性扩增的目的。PCR技术分为普通PCR和实时荧光定量PCR两种。普通PCR技术主要用于定性检测，检测结果需电泳验证，容易受交叉污染产生假阳性结果。而实时荧光PCR通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板的定量分析，虽然与传统PCR相比，它具有特异性强、准确度高、PCR污染少、自动化程度高等优点，但是操作较为复杂，成本高，耗时长，对实验者的技能要求高等。以上现有的芹菜过敏原检测方法均对操作人员的技术水平要求较高且需要很复杂精密的仪器设备作为配合，有些方法耗时长，有些方法成本相对较高，种种苛刻要求使以上方法走进家庭成为不可能。因此，现有的芹菜过敏原检测方法有待进一步改进。
技术实现思路
针对现有芹菜过敏原检测方法的操作难度高、耗时长、对操作人员技术要求高、不易走入家庭的问题，本专利技术提供了一种家用型检测芹菜过敏原的高灵敏试剂盒、其检测方法和应用，该方法在胶体金免疫学方法基础上改良金标微孔得到的一种高效检测芹菜过敏源的新方法。为解决上述问题，本专利技术提供以下技术方案：第一方面，本申请公开了一种家用型检测芹菜过敏原的高灵敏试剂盒，其包括：试纸条：NC膜上的检测线上包被鼠抗芹菜单克隆抗体1，浓度为0.1～0.5mg/ml，质控线上包被羊抗小鼠IgG，浓度为2～8mg/ml；试纸条由上至下为吸水纸、NC膜，样品垫，固定于PVC胶板上；其中，吸水纸和样品垫与NC膜重叠部分为2mm。金标微孔：将芹菜金标抗体与冻干稀释液的混合液加入到低吸附酶标板的微孔后进行冻干得到；其中，所述芹菜金标抗体是用链霉亲和素金标复合物和生物素标记牛血清白蛋白金标复合物组成的网状结构来标记生物素化芹菜抗体2而制备得到。优选地，所述高灵敏试剂盒还包括：还包括用于提取样品中的芹菜抗原的萃取液，萃取液主要由以下浓度的各组分组成：摩尔浓度为0.05～0.1M的Tris-HCl、质量体积浓度为0.5～1.5％的TritonX-100、质量体积浓度为0.5～3％的NaCl、体积浓度5～30％的乙醇、质量体积浓度为0.01％～0.1％的NaN3，溶剂为水，pH为9.0。第二方面，本专利技术提供一种芹菜过敏原的家用型检测方法，其采用上述的试剂盒进行检测，方法包括以下步骤：(1)提取待测样品中的抗原，得到提取液；(2)向金标微孔中加入3～4滴提取液，吹打多次以完全溶解微孔内的粉色粉末，室温孵育后，将试纸条MAX端向下插入微孔内，5min后根据试剂条的显色结果判断样品中是否含有芹菜过敏原；判断依据为：当只有质控线显色时，判定检测结果为阴性；当检测线和质控线同时显色时，判定检测结果为阳性；当质控线不显色，不管检测结果显色与否，都判定检测结果为无效。优选地，所述家用型检测方法，由样品制备提取液的方法为：将2～4ml萃取液和一个磁珠加入到5ml小瓶中；向小瓶中直接加入液体样本或固体样本后，上下震摇小瓶30s，静止至少1min后，吸取上清得到提取液；其中，萃取液主要由以下浓度的各组分组成：摩尔浓度为0.05～0.1M的Tris-HCl、质量体积浓度为0.5～1.5％的TritonX-100、质量体积浓度为0.5～3％的NaCl、体积浓度5～30％的乙醇、质量体积浓度为0.01％～0.1％的NaN3，溶剂为水，pH为9.0。第三方面，本专利技术还提供一种上述家用型检测芹菜过敏原的高灵敏试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：(1)芹菜金标抗体的制备：A、向制备好的胶体金中加入碳酸钾，混合均匀后，边搅拌边加入链霉亲和素，室温反应1～4h后，再逐滴加入牛血清白蛋白，室温反应1～4h后，离心收集沉淀并用复溶液重悬，得到链霉亲和素金标复合物溶液；B、向制备好的胶体金中加入碳酸钾，混合均匀后，边搅拌边加入生物素标计牛血清白蛋白，室温反应1～4h，再逐滴加入牛血清白蛋白，室温反应1～4h再逐滴加入牛血清白蛋白，反应后离心收集沉淀，将沉淀用复溶液重悬，得到生物素标记牛血清白蛋白金标复合物；C、将前两步得到的链霉亲和素金标复合物和生物素标记牛血清白蛋白金标复合物以1：3～1:30的比例进行混匀，并边搅拌边按照8～24ug/ml的比例加入生物素化鼠抗芹菜单克隆抗体2，室温反应1～4h或4度过夜，得到芹菜金标抗体。(2)金标微孔的制备：将芹菜金标抗体溶液与冻干稀释液以1:(10～15)的体积比进行混合，将混合液分装到低吸附酶标板中，在冰箱中冷冻过夜，再进行真空冷冻干燥至少20h后，扣合酶标板帽，得到金标微孔；(3)试纸条的准备：由上至下将吸水纸、NC膜，样品垫和MAX线固定在PVC胶板上，制备得到试纸条；NC膜上检测线包被鼠抗芹菜单克隆抗体1，浓度为0.5～2mg/ml，质控线包被羊抗小鼠IgG，浓度为1～5mg/ml。优选地，步骤(1)的方法具体为：A、向制备好的胶体金中加入碳酸钾，混合均匀后，边搅拌边加入链霉亲和素，室温反应2h后，再逐滴加入10％牛血清白蛋白，室温反应2h后，离心收集沉淀并用10ml复溶液重悬，得到链霉亲和素金标复合物溶液；B、向制备好的胶体金中加入碳酸钾，混合均匀后，边搅拌边加入生物素标计牛血清白蛋白，室温反应2h，再逐滴加入10％牛血清白蛋白1000ul，室温反应2h，再逐滴加入10％牛血清白蛋白，反应1h，离心收集沉淀，将沉淀用10ml复溶液重悬，得到生物素标记牛血清白蛋白金标复合物；C、将前两步得到的链霉亲和素金标复合物和生物素标记牛血清白蛋白金标复合物以1:5的比例进行混匀，并边搅拌边加入生物素化鼠抗芹菜单克隆抗体2，室温反应2h或4度过夜，得到芹菜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种家用型检测芹菜过敏原的高灵敏试剂盒，其特征在于，包括：/n试纸条：NC膜上的检测线上包被鼠抗芹菜单克隆抗体1，浓度为0.1～0.5mg/ml，质控线上包被羊抗小鼠IgG，浓度为2～8mg/ml；试纸条由上至下为吸水纸、NC膜，样品垫，固定于PVC胶板上；其中，吸水纸和样品垫与NC膜重叠部分为2mm。/n金标微孔：将芹菜金标抗体与冻干稀释液的混合液加入到低吸附酶标板的微孔后进行冻干得到；/n其中，所述芹菜金标抗体是用链霉亲和素金标复合物和生物素标记牛血清白蛋白金标复合物连接的网状结构来标记生物素化芹菜抗体2而制备得到。/n

【技术特征摘要】
1.一种家用型检测芹菜过敏原的高灵敏试剂盒，其特征在于，包括：
试纸条：NC膜上的检测线上包被鼠抗芹菜单克隆抗体1，浓度为0.1～0.5mg/ml，质控线上包被羊抗小鼠IgG，浓度为2～8mg/ml；试纸条由上至下为吸水纸、NC膜，样品垫，固定于PVC胶板上；其中，吸水纸和样品垫与NC膜重叠部分为2mm。
金标微孔：将芹菜金标抗体与冻干稀释液的混合液加入到低吸附酶标板的微孔后进行冻干得到；
其中，所述芹菜金标抗体是用链霉亲和素金标复合物和生物素标记牛血清白蛋白金标复合物连接的网状结构来标记生物素化芹菜抗体2而制备得到。


2.根据权利要求1所述的高灵敏试剂盒，其特征在于，还包括用于提取样品中的芹菜抗原的萃取液，萃取液主要由以下浓度的各组分组成：摩尔浓度为0.05～0.1M的Tris-HCl、质量体积浓度为0.5～1.5％的TritonX-100、质量体积浓度为0.5～3％的NaCl、体积浓度5～30％的乙醇、质量体积浓度为0.01％～0.1％的NaN3，溶剂为水，pH为9.0。


3.一种芹菜过敏原的家用型检测方法，其特征在于：采用如权利要求1所述的试剂盒进行检测，方法包括以下步骤：
(1)提取待测样品中的抗原，得到提取液；
(2)向金标微孔中加入3～4滴提取液，吹打多次以完全溶解微孔内的粉色粉末，将试纸条MAX端向下插入微孔内，10min后根据试剂条的显色结果判断样品中是否含有芹菜过敏原；
判断依据为：当只有质控线显色时，判定检测结果为阴性；当检测线和质控线同时显色时，判定检测结果为阳性；当质控线不显色，不管检测结果显色与否，都判定检测结果为无效。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，由样品制备提取液的方法为：
将2～4ml萃取液和一个磁珠加入到5ml小瓶中；向小瓶中直接加入液体样本或固体样本后，上下震摇小瓶30s，静止至少1min后，吸取上清得到提取液；
其中，萃取液主要由以下浓度的各组分组成：摩尔浓度为0.05～0.1M的Tris-HCl、质量体积浓度为0.5～1.5％的TritonX-100、质量...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈佳琛，李妍，于秋香，孙锡仕，
申请(专利权)人：青岛普瑞邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37