一种检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法以及应用技术

一种检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法及其应用，它涉及一种试纸的制备方法以及应用。本发明专利技术为了解决目前阪崎克罗诺杆菌的检测方法中存在的检测时间长、成本高问题，以及提高检测方法的灵敏度的问题。试纸的制备：一、制备单克隆抗体；组装SERS免疫探针；三、试纸条的组装；所述的试纸在检测阪崎克罗诺杆菌中的应用。本发明专利技术的试纸测定时间短且易于操作，成本低，具有优异的灵敏度，能够定量检测，本发明专利技术的试纸可以简便、快速地定量检测工业.食品中阪崎克罗诺杆菌。

【技术实现步骤摘要】
一种检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法以及应用
本专利技术涉及一种试纸的制备方法以及应用。
技术介绍
阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)，曾命名为Enterobactersakazakii，是引起诸如菌血症，新生儿脑膜炎和坏死性小肠结肠炎等传染病的病原体，致死率很高。婴幼儿配方奶粉经常被阪崎克罗诺杆菌污染。欧盟(欧洲委员会，2005年)规定食品中提取30×10克婴幼儿配方奶粉不得存在阪崎克罗诺杆菌。当前，关于阪崎克罗诺杆菌的检测方法包括有生化反应或聚合酶链反应(PCR)技术、PCR方法、实时荧光PCR方法等，但是这些方法普遍存在检测时间长、检测成本高的问题，基于免疫识别的免疫层析试纸条由于其具有高特异性，以及易于现场检测的特点，引起了越来越多的关注，然而，对于病原体检测，需要提高试纸条的敏感性和准确性。在试纸条检测中，用单克隆抗体标记金纳米颗粒(AuNPs)，导致抗体与抗原特异性结合时由于胶体金的积聚而发生颜色变化实际上，在肉眼观察到颜色变化之前，抗原/抗体已经有少量的结合。因此，在发生少量的抗原/抗体结合时，就需要检测到信号以此来提高检测方法的灵敏度，但是目前的检测方法普遍存在灵敏度低的问题，无法准确的完成检测。
技术实现思路
本专利技术为了解决目前阪崎克罗诺杆菌的检测方法中存在的检测时间长、成本高、只能定性检测问题，以及为了提高检测方法的灵敏度，实现定量检测，而提供了一种检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法以及应用。本专利技术检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法，按照以下步骤进行：步骤一、利用杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，杂交瘤细胞株2H10保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏号为CCTCCNO：C2020242，保藏日期为2020年12月9日；步骤二、拉曼报告分子、单克隆抗体添加到胶体金溶液中，得到SERS免疫探针；步骤三、试纸条的组装；即得到了检测阪崎克罗诺杆菌的试纸。上述试纸在检测阪崎克罗诺杆菌中的应用，具体的应用方法：将上述的阪崎克罗诺杆菌试纸条浸入含有待测物的SERS免疫探针溶液中，进行显色，然后再用拉曼光谱分析仪进行分析，即完成了阪崎克罗诺杆菌的检测。上述步骤一中的杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心。保藏单位地址为中国武汉武汉大学。本专利技术的试纸是基于免疫层析和表面增强拉曼散射(SERS)的免疫层析试纸，对阪崎克罗诺杆菌的检测具有高度特异性，并通过测定SERS信号大大提高该方法的灵敏度，本专利技术可以根据测试线的颜色变化在12分钟内通过视觉评估阪崎克罗诺杆菌是否存在，测试线上免疫探针(mAb-Au-PATP)产生的拉曼信号强度与样品中的阪崎克罗诺杆菌浓度高度相关，从而可以准确定量阪崎克罗诺杆菌浓度。本专利技术的定量检测范围为102～107cfu/mL，LOD为201cfu/mL，准确度为99～104％。本专利技术的试纸测定时间短且易于操作，成本低，本专利技术的试纸中拉曼报告分子标记胶体金标记抗体，具有优异的灵敏度，实现了定量检测，本专利技术的试纸可以简便、快速地定量检测工业食品中阪崎克罗诺杆菌。附图说明图1是免疫探针的制备流程图；图2是不同阪崎克罗诺杆菌浓度检测结果图；图3是拉曼图；图4是定量分析得到非线性校准曲线图；图5是重现性效果图；图6是特异性效果图。图7是奶粉中阪崎克罗诺杆菌含量的曲线图。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法，按照以下步骤进行：步骤一、利用杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，杂交瘤细胞株2H10保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏号为CCTCCNO：C2020242，保藏日期为2020年12月9日；步骤二、拉曼报告分子、单克隆抗体添加到胶体金溶液中，得到SERS免疫探针；步骤三、试纸条的组装；即得到了检测阪崎克罗诺杆菌的试纸。本专利技术步骤一单克隆抗体的制备方法：复苏阪崎克罗诺杆菌ATCC29544(美国典型培养物保藏中心)，37℃培养20～28小时；然后以3500-5,000×g收集阪崎克罗诺杆菌细胞10分钟，在26℃下，以200-350瓦的声波将颗粒超声破碎30-70次，持续5s，间隔为9s(VCX605，Sonics，美国)；再用等量的50-90％提取裂解液，在40-70℃下保持30分钟，然后在室温下使用5,000-9,000MW的透析管(德国汉堡的BiomolGmbH)透析管透析48小时；透析液用PEG20000浓缩并纯化，得到粗制LPS(脂多糖)，与弗氏完全佐剂混合乳化后免疫8周龄BALB/c雌性小鼠，随后每2周免疫一次，共5次免疫(Scharinger等人，2003)；免疫的小鼠处死后收集其脾淋巴细胞，在PEG1500中以5：1的比例与骨髓瘤细胞融合，筛选后得到具有高抗体活性的杂交瘤细胞(杂交瘤细胞保藏号为CCTCCNO：c2020242)；将杂交瘤细胞(保藏号为CCTCCNO：c2020242)用含10％小牛血清的RPMI1640培养基传代培养，并冷冻保存在液氮中；向8周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔注射0.5mL石蜡；7天后，将杂交瘤细胞重悬于RPMI1640培养基中，向小鼠腹膜内注射(Wu等，2015；Scharinger等，2016)。然后收集腹水，并通过辛酸-硫酸铵方法纯化单克隆抗体(mAbs)(Shi等，2018)。使用小鼠单克隆抗体Ig/亚类检测试剂盒(ThermoScientific，西棕榈滩，美国)确定抗体亚型(Jaradat等，2011)。本专利技术步骤二中免疫探针(mAb-Au-PATP)的制备如图1所示，即是通过将拉曼报告分子(PATP)和抗体顺序添加到胶体金溶液中来组装免疫探针(mAb-Au-PATP)。具体方法为：用0.1mol/LK2CO3调节胶体金溶液至pH为7～9，随后，将8～12mL胶体金溶液与8～12μL1mmol/LPATP溶液混合(PATP标记到胶体金颗粒溶液)，并在25℃下搅拌15min；将混合物在4℃下静置1h，然后将针对阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体(mAb)加入0.5～2mLPATP标记的胶体金颗粒溶液中，在室温下搅拌15min，然后在4℃下静置1h即获得免疫探针mAb-Au-PATP。为了封闭非特异性结合位点，将100μL的5％BSA加入溶液中，并在4℃下放置过夜。最后，5000r/min离心10分钟并用磷酸钾缓冲液重悬，最终的mAb-Au-PATP溶液在4℃下保存。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中的胶体金溶液采用柠檬酸三钠还原法制备得到。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。本实施方式胶体金的制备方法为：用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，即将超纯水加热至沸腾，然后添加HAuCl4以获取300mL的0.01％水溶液；然后将2-6mL1％柠檬酸三钠溶液添加到沸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法，其特征在于检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法，按照以下步骤进行：/n步骤一、利用杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：c2020242，保藏日期为2020年12月9日；/n步骤二、拉曼报告分子、单克隆抗体添加到胶体金溶液中，得到SERS免疫探针；/n步骤三、试纸条的组装；即得到了检测阪崎克罗诺杆菌的试纸。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法，其特征在于检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法，按照以下步骤进行：
步骤一、利用杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：c2020242，保藏日期为2020年12月9日；
步骤二、拉曼报告分子、单克隆抗体添加到胶体金溶液中，得到SERS免疫探针；
步骤三、试纸条的组装；即得到了检测阪崎克罗诺杆菌的试纸。


2.根据权利要求1所述的检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法，其特征在于步骤二中的胶体金溶液采用柠檬酸三钠还原法制备得到。


3.根据权利要求1所述的检测阪崎...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟利，武晋慧，高思远，刘峰，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23