一种提取纯化AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的方法技术

本申请涉及一种提取纯化AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的方法，包括如下步骤：毒素提取；初次分离：将毒素提取得到的粗提液经过乙酸乙酯

【技术实现步骤摘要】
一种提取纯化AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的方法


[0001]本申请涉及生物毒素提取纯化
，更具体地说，它涉及一种提取纯化AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的方法。

技术介绍

[0002]黄曲霉毒素(AFT)是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的双呋喃环类毒素，是毒性极大、致癌性极强的一种霉菌毒素。由于黄曲霉毒素的理化性质稳定，可以在有机体之间通过食物链转移，严重威胁着人类的身体健康，给农副产品造成巨大的经济损失，因此引起了广泛的关注。
[0003]近年来，AFT毒理方面的研究已成为真菌毒素领域的一个热点，这就需要大量的高纯度AFT来满足毒理研究的需要。AFT的衍生物有约20种，根据其在长波紫外光下产生的荧光颜色、RF值以及结构不同等特点将其分别命名为B1(AFB1)、B2(AFB2)、G1(AFG1)、G2(AFG2)、M1、M2、P1、R1、GM和毒醇等，其中，因AFB1、AFB2、AFG1、AFG2具有较高的毒性而被广泛研究。
[0004]目前AFB1、AFB2、AFG1、AFG2主要是从人工接种的培养基中提取纯化目标化合物，其中AFB1、AFG1的产量相对较高，而AFB2、AFG2的产量相对较低，并且由于AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的性质相近，使其很难完全分离，导致提取流程繁琐复杂。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本申请提供一种提取纯化AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的方法，其不仅能够将AFB1、AFB2、AFG1、AFG2完全分离，而且还可以提高AFB2、AFG2的产量。
[0006]第一方面，本申请提供一种提取纯化AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的方法，采用如下的技术方案：
[0007]一种提取纯化AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的方法，包括如下步骤：
[0008]毒素提取：向含有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的产毒培养基中加入提取剂，经过提取后，得到含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的粗提液；
[0009]初次分离：采用制备液相色谱法，使用乙酸乙酯
‑
二氯甲烷对粗提液进行洗脱，分别收集含AFB1/AFG1的馏分和含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的馏分；
[0010]制备AFB1和AFG1：采用制备液相色谱法，使用甲苯
‑
(乙酸乙酯
‑
甲醇
‑
乙酸)对含AFB1/AFG1的馏分进行洗脱，分别收集含AFB1的馏分和含AFG1的馏分；然后分别将含AFB1的馏分和含AFG1的馏分进行纯化处理，得到AFB1和AFG1；
[0011]制备AFB2和AFG2：将含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的馏分经过加氢还原反应，得到含AFB2/AFG2的样品；采用制备液相色谱法，使用甲苯
‑
(乙酸乙酯
‑
甲醇
‑
乙酸)对含AFB2/AFG2的样品进行洗脱，分别收集含AFB2的馏分和含AFG2的馏分；然后分别将含AFB2的馏分和含AFG2的馏分进行纯化处理，得到AFB2和AFG2。
[0012]通过采用上述技术方案，本申请采用分步提取的方式，通过对产毒培养基中的
AFB1、AFB2、AFG1、AFG2进行提取，得到含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的提取液；在初步分离时，采用乙酸乙酯
‑
二氯甲烷进行洗脱，得到含AFB1/AFG1的馏分，再继续洗脱一定时间后，可以将AFB2/AFG2洗脱出来，则剩余馏分中同时含有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，然后再分别对含AFB1/AFG1的馏分和含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的馏分进行分离提取。通过使用甲苯
‑
(乙酸乙酯
‑
甲醇
‑
乙酸)对含AFB1/AFG1的馏分进行洗脱，可以得到含AFB1的馏分和含AFG1的馏分。
[0013]由于AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的性质相近，在分离出含AFB1/AFG1的馏分后，体系中仍然会有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的混合物，导致分离提取的过程繁琐，且产品纯度低，AFB2、AFG2的产量低。而本申请通过对初步分离得到的含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的馏分进行加氢还原处理后，使得AFB1、AFG1都转化为AFB2、AFG2，此时，既解决了AFB1、AFG1与AFB2、AFG2难以分离的问题，又可以增加AFB2、AFG2的产量。并且，提取分离步骤少，可以有效提高生产效率。
[0014]可选的，所述制备AFB2和AFG2步骤中，加氢还原反应包括如下步骤：
[0015]将含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的馏分经过浓缩至干后，得到含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的样品；
[0016]向含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的样品中加入1,4
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二氧六环，搅拌溶解，得到混合液；
[0017]向混合液中加入催化剂，然后通入氢气，在55
‑
65℃的温度下搅拌反应15
‑
20h，得到含AFB2/AFG2的样品。
[0018]可选的，所述含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的样品与1,4
‑
二氧六环的重量比为1:15
‑
25。
[0019]可选的，所述含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的样品与催化剂的重量比为10:0.8
‑
1.2。
[0020]可选的，所述催化剂为Pd
‑
CaCO3催化剂。
[0021]可选的，所述初步分离中，以乙酸乙酯为流动相A，以二氯甲烷为流动相B，采用梯度洗脱程序进行提取分离；
[0022]所述梯度洗脱程序为：0min，20％A和80％B；5min，20％A和80％B；10min，30％A和70％B；20min，30％A和70％B；30min，40％A和60％B；
[0023]含AFB1/AFG1的馏分收集时间为16.1
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21.7min，含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的馏分收集时间为21.7
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24.6min。
[0024]通过采用上述技术方案，采用上述的洗脱程序进行洗脱，其洗脱时间短，分离效率高。
[0025]可选的，所述制备AFB1和AFG1步骤中，以甲苯为流动相A，以乙酸乙酯
‑
甲醇
‑
乙酸为流动相B，采用梯度洗脱程序进行提取分离；
[0026]所述梯度洗脱程序为：0min，5％A和95％B；5min，5％A和95％B；10min，10％A和90％B；20min，10％A和90％B；30min，15％A和85％B；
[0027]含AFB1的馏分收集时间为17.1
‑
20.2min，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提取纯化AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的方法，其特征在于，包括如下步骤：毒素提取：向含有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的产毒培养基中加入提取剂，经过提取后，得到含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的粗提液；初次分离：采用制备液相色谱法，使用乙酸乙酯
‑
二氯甲烷对粗提液进行洗脱，分别收集含AFB1/AFG1的馏分和含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的馏分；制备AFB1和AFG1：采用制备液相色谱法，使用甲苯
‑
(乙酸乙酯
‑
甲醇
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乙酸)对含AFB1/AFG1的馏分进行洗脱，分别收集含AFB1的馏分和含AFG1的馏分；然后分别将含AFB1的馏分和含AFG1的馏分进行纯化处理，得到AFB1和AFG1；制备AFB2和AFG2：将含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的馏分经过加氢还原反应，得到含AFB2/AFG2的样品；采用制备液相色谱法，使用甲苯
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(乙酸乙酯
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甲醇
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乙酸)对含AFB2/AFG2的样品进行洗脱，分别收集含AFB2的馏分和含AFG2的馏分；然后分别将含AFB2的馏分和含AFG2的馏分进行纯化处理，得到AFB2和AFG2。2.根据权利要求1所述的一种提取纯化AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的方法，其特征在于，所述制备AFB2和AFG2步骤中，加氢还原反应包括如下步骤：将含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的馏分经过浓缩至干后，得到含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的样品；向含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的样品中加入1,4
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二氧六环，搅拌溶解，得到混合液；向混合液中加入催化剂，然后通入氢气，在55
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65℃的温度下搅拌反应15
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20h，得到含AFB2/AFG2的样品。3.根据权利要求2所述的一种提取纯化AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的方法，其特征在于，所述含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的样品与1,4
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二氧六环的重量比为1:15
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25。4.根据权利要求2所述的一种提取纯化AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的方法，其特征在于，所述含AFB1/AFG1/AFB2/AFG2的样品与催化剂的重量比为10:0.8
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1.2。5.根据权利要求1所述的一种提取纯化AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘红兵，崔涛，于秋香，
申请(专利权)人：青岛普瑞邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：