一种检测地中海贫血基因的参考品及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种检测地中海贫血基因的参考品及其制备方法与应用。所述参考品包括片段化的母体基因组DNA和片段化的胎儿基因组DNA。使用本发明专利技术的参考品进行文库构建，并且分别使用用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上、下游引物组进行两轮特异性扩增，能够准确、高效地检测α型地贫基因突变，其结果与羊水穿刺检测分型一致，但安全性、无创性和高效性方面明显优于羊水穿刺检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测地中海贫血基因的参考品及其制备方法与应用
本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种检测地中海贫血基因的参考品及其制备方法与应用。
技术介绍
地中海贫血(Thalassemia)是我国长江以南各省(区)发病率最高的一种单基因遗传病，主要类型是α和β地中海贫血，分别是由于α或β珠蛋白基因发生缺失或者点突变，使其编码的人α或β珠蛋白链缺失或不足，导致严重的溶血性贫血。当α-珠蛋白基因全部缺失(--/--，重型α-地贫)时，患者在胎儿时期发病，表现为重度贫血伴全身水肿等症状(HbBarts’hydropsfetalis，巴氏胎儿水肿综合征)。该疾病对胎儿来说是致命的，同时可能对母体带来严重甚至危及生命的并发症。目前地中海贫血主要靠输血和去铁治疗维持，也可采用骨髓移植治疗手段，但代价十分昂贵，对患儿家庭带来沉重负担。通过产前诊断选择性流产受累胎儿是世界上公认的首选对策。因此，针对高风险地中海贫血胎儿的产前诊断是实现人群预防和控制的重要手段。随着DNA分析技术的不断发展，各种快速、简便的产前诊断方法被应用于地中海贫血的产前诊断。然而，传统获取胎儿遗传物质进行的产前诊断为有创性操作，即通过穿刺手术采集绒毛、羊水或脐带血，可能造成胎儿损伤、流产或宫内感染等风险。相关研究发现妊娠母体血浆中存在胎儿DNA，基于此类胎儿遗传物质的产前诊断更安全，且易于被受试者接受，也避免了获取胎儿遗传物质的创伤性操作导致的不必要风险。随着无创产前检测技术应用于临床，单基因病无创产前诊断对于地中海贫血的防控具有重要意义。基于二代测序技术检测胎儿游离DNA进行地中海贫血无创产前筛查是本领域重要进展。利用二代测序技术对母体外周血浆中游离DNA进行测序，并将测序结果进行生物信息分析，得到胎儿的遗传信息。但目前该技术的发展受到参考品获取方面的限制，目前针对无创产前地中海贫血基因检测技术没有参考品，从而严重制约了相关产品研发和现有产品的质量控制。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种检测地中海贫血基因的参考品，能够根据胎儿DNA含量和地中海贫血基因位点的检测频率，获得母体和胎儿的基因型信息。本专利技术还提出一种具有上述参考品的制备方法。根据本专利技术的第一方面，提出了一种检测地中海贫血基因的参考品，所述参考品包括片段化的母体基因组DNA和片段化的胎儿基因组DNA。在本专利技术的一些实施方式中，所述片段化的母体基因组DNA包括来源于地中海贫血基因杂合子、阴性母体组织或外周血白细胞的基因组的片段化核酸；所述片段化的胎儿基因组DNA包括来源于地中海贫血基因纯合突变、杂合子、阴性胎儿组织或外周血白细胞的基因组的片段化核酸。在本专利技术的一些实施方式中，所述片段化的母体基因组DNA包括来源于母体组织或外周血的基因组的片段化核酸；片段化的胎儿基因组DNA包括来源于胎儿组织或外周血的基因组的片段化核酸。在本专利技术的一些实施方式中，所述片段化的母体基因组DNA的α-地贫SEA位点为野生型或杂合突变；所述片段化的胎儿基因组DNA的α-地贫SEA位点为野生型、纯合突变或杂合突变。在本专利技术的一些实施方式中，片段化的母体DNA和片段化的胎儿DNA的片段大小为150-200bp。在本专利技术的一些实施方式中，片段化的胎儿DNA的含量占参考品总量的5-30％(v/v)。根据本专利技术的第二方面，提出了上述参考品的制备方法，所述制备方法如下步骤：S1、分别提取、纯化母体样本和胎儿样本的基因组DNA；S2、将步骤S1所得的基因组DNA片段化；S3、将步骤S2片段化的母体基因组DNA和胎儿基因组DNA按比例配制成参考品，其中，片段化的胎儿基因组DNA的含量占参考品总量的5-30％。在本专利技术的一些实施方式，所述步骤S1中，所述母体样本的α-地贫SEA位点为野生型或杂合突变；所述胎儿样本的α-地贫SEA位点为野生型、纯合突变或杂合突变。在本专利技术的一些实施方式，所述步骤S1中，样本为人体组织或外周血。在本专利技术的一些实施方式，基因组DNA的样本类型分为样本1-样本5，其中，样本1为α-地贫SEA位点为纯合突变(--SEA/--SEA)的胎儿组织样本，样本2为α-地贫SEA位点为杂合突变(--SEA/αα)的胎儿组织样本，样本3为α-地贫SEA位点为野生型(αα/αα，下同)的胎儿组织样本，样本4为α-地贫SEA位点为杂合突变(--SEA/αα)的女性的外周血样本，样本5为α-地贫SEA位点为野生型(αα/αα)的女性的外周血样本。在本专利技术的一些实施方式，所述步骤S1中，基因组DNA提取采用基因组提取试剂盒QiagenDNeasyBlood&TissueKit。在本专利技术的一些实施方式，所述步骤S1中，基因组纯化采用试剂盒GenomicDNAClean&Concentrator-10进行纯化。在本专利技术的一些实施方式，所述步骤S2中，基因组DNA片段化采用超声波细胞破碎仪破碎细胞。在本专利技术的一些实施方式，所述超声波细胞破碎仪采用的参数为超声波功率70～80W，温度4～12℃，时间5～8min。在本专利技术的一些实施方式，所述超声波细胞破碎仪采用的参数为超声波功75W，温度10℃，时间6min。在本专利技术的一些实施方式，所述步骤S3中，所述参考品为R1-R5。在本专利技术的一些实施方式，所述参考品R1由90％样本4片段化的母体DNA(--SEA/αα)和10％样本1片段化的胎儿DNA(--SEA/--SEA)组成；所述参考品R2由90％样本4片段化的母体DNA(--SEA/αα)和10％样本2片段化的胎儿DNA(--SEA/αα)组成；所述参考品R3由90％样本4片段化的母体DNA(--SEA/αα)和10％样本3片段化的胎儿DNA(αα/αα)组成；所述参考品R4由90％样本5片段化的母体DNA(αα/αα)和10％样本2片段化的胎儿DNA(--SEA/αα)组成；所述参考品R5由90％样本4片段化的母体DNA(--SEA/αα)和10％样本3片段化的胎儿DNA(αα/αα)组成。本专利技术第三方面提供一种用于地中海贫血突变型与缺失型基因检测的引物组，所述引物组包括如SEQIDNO.1～SEQIDNO.44所示的引物。在本专利技术的一些实施方式，所述的引物组包括引物分组1、引物分组2，其中，所述引物分组1由SEQIDNO.1～SEQIDNO.22混合配制而成，所述引物分组2为SEQIDNO.23～SEQIDNO.44混合配制而成。在本专利技术的一些实施方式，所述的引物组中上游特异性引物组1包括用于扩增α型地贫基因的上游引物组1以及用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组1；所述下游特异性引物组1包括用于扩增α型地贫基因的下游引物组1以及用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组1；所述上游特异性引物组2包括用于扩增α型地贫基因的上游引物组2以及用于计算胎儿游离D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测地中海贫血基因的参考品，其特征在于，包括：片段化的母体基因组DNA和片段化的胎儿基因组DNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测地中海贫血基因的参考品，其特征在于，包括：片段化的母体基因组DNA和片段化的胎儿基因组DNA。


2.根据权利要求1所述的参考品，其特征在于，所述片段化的母体基因组DNA的α-地贫SEA位点为野生型或杂合突变；所述片段化的胎儿基因组DNA的α-地贫SEA位点为野生型、纯合突变或杂合突变。


3.根据权利要求1所述的参考品，其特征在于，片段化的母体基因组DNA包括来源于母体组织或外周血的基因组的片段化核酸；片段化的胎儿基因组DNA包括来源于胎儿组织或外周血的基因组的片段化核酸。


4.根据权利要求1所述的参考品，其特征在于，片段化的母体DNA和片段化的胎儿DNA的片段大小分别为150-200bp。


5.根据权利要求1-4任一项所述的参考品，其特征在于，片段化的胎儿基因组DNA的含量占参考品总量的5-30％。


6.一种用于检测地中海贫血基因的参考品的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下步骤：
S1、分别提取、纯化母体样本和胎儿样本的基因组DNA；
S2、将步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓锋，袁梦兮，黄文静，赵鑫，王益民，朱碧银，卜中鑫，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43