一种量子点标记的直接竞争荧光免疫检测超氧化物歧化酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种量子点标记的直接竞争荧光免疫检测超氧化物歧化酶的方法，该方法使用CdSe/ZnS量子点标记超氧化物歧化酶，形成了超氧化物歧化酶-量子点荧光探针(QDs-SOD)复合物，通过QDs-SOD复合物和待测样品液中的超氧化物歧化酶与包被的超氧化物歧化酶多克隆抗体进行直接竞争性地结合，来检测待测样品液中的超氧化物歧化酶的浓度。本发明专利技术的方法具有高灵敏度、高特异性和操作简单等特点，可用于超氧化物歧化酶的快速检测。氧化物歧化酶的快速检测。氧化物歧化酶的快速检测。

【技术实现步骤摘要】
一种量子点标记的直接竞争荧光免疫检测超氧化物歧化酶的方法


[0001]本专利技术属于免疫检测方法
，具体而言，本专利技术涉及量子点标记的直接竞争荧光免疫检测超氧化物歧化酶的方法以及一种超氧化物歧化酶检测试剂盒。

技术介绍

[0002]超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)，广泛存在于动植物的细胞与组织中，是生物防御体系的关键酶之一。SOD可以消除动植物在新陈代谢过程中产生的活性氧等有害物质，维持其正常的生命活动、增强植物防御能力和延缓衰老等作用。在动植物的生长过程中和番茄等农副产品的贮藏期间，由于细胞新陈代谢的影响，SOD的含量不断发生变化。因此，超氧化物岐化酶的含量可以间接反映农副产品在在贮藏过程中的变化，所以SOD的含量是评判番茄等农副产品新鲜度的一个重要指标。
[0003]目前，国内外常用的超氧化物歧化酶检测方法主要有：滴定法、氧化还原法、分光光度法和化学发光法等。然而，通过实际应用，发现这些现有的方法操作繁琐、费时费力，准确度低，不是理想的检测方法。国外已开展的对蛋白及酶类的分析方法的研究，常用的方法为酶联免疫分析法(ELISA)。这类方法将抗体包被酶标板，加入蛋白及酶类进行特异性结合，再加入酶标抗体(即检测抗体)，最后加入底物显色，一定时间后，用酶标仪检测某一特定波长的吸光度值，根据一直标准品含量计算样品中待测药物的浓度，此操作繁琐，费时。
[0004]因此，目前仍需要一种检测超氧化物岐化酶的方法，以实现超氧化物岐化酶的快速准确的检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供量子点标记的直接竞争荧光免疫检测超氧化物歧化酶的方法，该方法具有高灵敏度、高特异性和操作简单等特点，可用于超氧化物歧化酶的快速检测。
[0006]具体而言，本专利技术提供了一种量子点标记的直接竞争荧光免疫检测超氧化物歧化酶的方法，所述方法包括以下步骤：
[0007](1)用偶联剂对量子点进行活化，得到活化后的量子点；
[0008](2)将所述活化后的量子点与超氧化物歧化酶进行偶联，得到超氧化物歧化酶-量子点荧光探针(QDs-SOD)复合物；
[0009](3)用磷酸盐缓冲液稀释所述QDs-SOD复合物，得到QDs-SOD复合物稀释液；
[0010](4)在酶标板中对超氧化物歧化酶多克隆抗体进行包被，得到包被在所述酶标板中的超氧化物歧化酶多克隆抗体；
[0011](5)将所述QDs-SOD复合物稀释液和超氧化物歧化酶标准品溶液加入到所述酶标板中，通过与包被在所述酶标板中的超氧化物歧化酶多克隆抗体进行竞争性地结合，形成抗体-抗原发光免疫复合物；
[0012](6)用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗体-抗原发光免疫复合物的荧光强度，以所述超氧化物歧化酶标准溶液中的超氧化物歧化酶的浓度为横坐标，所获得的荧光强度为纵坐标，绘制得到标准曲线；
[0013](7)将步骤(5)中的所述超氧化物歧化酶标准品溶液替换为待测样品液，以与步骤(5)和(6)相同的操作，获得所述待测样品液对应的荧光强度，通过与所述标准曲线对比求出所述待测样品液中超氧化物歧化酶的浓度。
[0014]本专利技术还提供了一种超氧化物歧化酶检测试剂盒，所述试剂盒包含(a)超氧化物歧化酶-量子点荧光探针复合物；(b)包被的超氧化物歧化酶多克隆抗体；(c)任选的超氧化物歧化酶标准品；以及(d)用于检测超氧化物歧化酶的说明书。
[0015]有益效果
[0016](1)本方法操作简单，不需添加显色物质就能检测待测样品中超氧化物歧化酶的含量，即通过抗体-抗原免疫复合物的荧光强度，直接检测待测样品中超氧化物歧化酶的浓度值，无论操作还是反应只需一步就可以完成。
[0017](2)本方法特定地将量子点用于标记超氧化物歧化酶，与传统的荧光检测方法相比，本专利技术的量子点标记的超氧化物歧化酶发射的荧光强度更强，且荧光稳定时间长。
附图说明
[0018]图1代表CdSe/ZnS量子点(QDs)与超氧化物歧化酶(SOD)偶联前后的荧光光谱图，其中，上方曲线代表偶联前(即QDs)的荧光光谱曲线，下方曲线代表偶联后获得的超氧化物歧化酶-量子点荧光探针复合物(即QDs-SOD)的荧光光谱曲线。
[0019]图2是以不同浓度的超氧化物歧化酶标准溶液中的超氧化物歧化酶浓度为横坐标，以用本专利技术的方法检测得到的相应的荧光强度为纵坐标，建立获得的标准曲线。
[0020]图3是相对于空白对照的荧光强度，在各种干扰物质或超氧化物歧化酶磷酸盐溶液的存在下，QDs-SOD荧光探针与包被在酶标板上的固相抗体相结合形成的抗体-抗原发光免疫复合物的相对荧光强度的示意图。
[0021]图4为CdTe量子点和CdSe/ZnS量子点的光学稳定性的对比图。
[0022]图5为CdTe量子点和CdSe/ZnS量子点的储存稳定性的对比图。
具体实施方式
[0023]以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。
[0024]在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或数值，这些范围或数值应当理解为包含接近这些范围或数值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0025]在本专利技术中，除非特别指明，术语“室温”也可称为常温，是指15℃-30℃的温度。在本专利技术中，除非特别指明，实验温度均为室温。
[0026]在本专利技术中，除非另有说明，术语“溶液”是指以pH＝7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液为溶剂制备的溶液。
[0027]在一个实施方式中，本专利技术提供了一种量子点标记的直接竞争荧光免疫检测超氧化物歧化酶的方法，所述方法包括以下步骤：
[0028](1)用偶联剂对量子点进行活化，得到活化后的量子点；
[0029](2)将所述活化后的量子点与超氧化物歧化酶进行偶联，得到超氧化物歧化酶-量子点荧光探针(QDs-SOD)复合物；
[0030](3)用磷酸盐缓冲液稀释所述QDs-SOD复合物，得到QDs-SOD复合物稀释液；
[0031](4)在酶标板中对超氧化物歧化酶多克隆抗体进行包被，得到包被在所述酶标板中的超氧化物歧化酶多克隆抗体；
[0032](5)将所述QDs-SOD复合物稀释液和超氧化物歧化酶标准品溶液加入到所述酶标板中，通过与包被在所述酶标板中的超氧化物歧化酶多克隆抗体进行竞争性地结合，形成抗体-抗原发光免疫复合物；
[0033](6)用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗体-抗原发光免疫复合物的荧光强度，以所述超氧化物歧化酶标准溶液中的超氧化物歧化酶的浓度为横坐标，所获得的荧光强度为纵坐标，绘制得到标准曲线；
[0034](7)将步骤(5)中的所述超氧化物歧化酶标准品溶液替换为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种量子点标记的直接竞争荧光免疫检测超氧化物歧化酶的方法，所述方法包括以下步骤：(1)用偶联剂对量子点进行活化，得到活化后的量子点；(2)将所述活化后的量子点与超氧化物歧化酶进行偶联，得到超氧化物歧化酶-量子点荧光探针(QDs-SOD)复合物；(3)用磷酸盐缓冲液稀释所述QDs-SOD复合物，得到QDs-SOD复合物稀释液；(4)在酶标板中对超氧化物歧化酶多克隆抗体进行包被，得到包被在所述酶标板中的超氧化物歧化酶多克隆抗体；(5)将所述QDs-SOD复合物稀释液和超氧化物歧化酶标准品溶液加入到所述酶标板中，通过与包被在所述酶标板中的超氧化物歧化酶多克隆抗体进行竞争性地结合，形成抗体-抗原发光免疫复合物；(6)用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗体-抗原发光免疫复合物的荧光强度，以所述超氧化物歧化酶标准溶液中的超氧化物歧化酶的浓度为横坐标，所获得的荧光强度为纵坐标，绘制得到标准曲线；(7)将步骤(5)中的所述超氧化物歧化酶标准品溶液替换为待测样品液，以与步骤(5)和(6)相同的操作，获得所述待测样品液对应的荧光强度，通过与所述标准曲线对比求出所述待测样品液中超氧化物歧化酶的浓度。2.根据权利要求1所述的方法，在所述步骤(1)中，所述量子点的活化包括：向所述量子点中加入偶联剂和磷酸盐缓冲液，超声分散后，恒温反应预定时间，离心去掉上清，得到所述活化后的量子点；其中，所述偶联剂为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液和1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述步骤(1)进一步满足如下条件中的一项或多项：所述量子点为CdSe/ZnS量子点；所述NHS溶液的浓度为1mg/mL-10mg/mL、优选3mg/mL-6mg/mL；所述EDC溶液的浓度为1mg/mL-8mg/mL、优选2mg/mL-4mg/mL；对于100μL的所述量子点，使用100μL-300μL的所述NHS溶液和100μL-300μL的所述EDC溶液以及700μL-1000μL的所述磷酸盐缓冲液进行溶解；所述恒温反应在18℃-40℃、优选25℃-37℃下的恒温培养箱中在200rmp-250rmp下进行15min-30min；所述离心在8000rpm-12000rpm、优选8000rpm-10000rpm下进行5min-10min。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，在所述步骤(2)中，所述活化后的量子点与所述超氧化物歧化酶的偶联包括：用超氧化物歧化酶溶液对所述活化后的量子点进行复溶，超声分散后，恒温下避光反应预定时间，离心去掉游离的超氧化物歧化酶，得到所述QDs-SOD复合物；优选地，所述步骤(2)进一步满足如下条件中的一项或多项：所述超氧化物歧化酶溶液的浓度为0.1mg/mL-5mg/mL、优选1mg/mL-3mg/mL；所述避光反应在18℃-40℃、优选25℃-37℃下的恒温培养箱中在100rpm-400rpm、优选
200rpm-250rpm下进行1h-3h、优选1.5h-2h；所述离心在6000rpm-12000rpm、优选8000rpm-10000rpm下进行3min-20min、优选5min-10min。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，在所述步骤(3)中，所述QDs-SOD复合物的稀释包括：用复溶液对所述QDs-SOD复合物进行复溶，超声震荡混匀后，用磷酸盐缓冲液进行稀释，得到所述QDs-SOD复合物稀释液；优选地，所述步骤(3)进一步满足如下条件中的一项或多项：所述复溶液是1mL的含有1％BSA和0.5％吐温-20的磷酸盐缓冲液；所述超声震荡在18℃-40℃、优选25℃-37℃下的摇床中在100rpm-400rpm、优选200rpm-250rpm下进行1h-2h；所述稀释的倍数为10-500倍、优选50-200、进一步优选50-100倍。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，在所述步骤(4)中，所述超氧化物歧化酶多克隆抗体的包被包括：使用磷酸盐缓冲液对超氧化物歧化酶多克隆抗体进行稀释100-2000倍、优选500-1000倍，获得抗体稀释液；将所述抗体稀释液加入到所述酶标板中，包被过夜后，用含0.5％吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤并甩干，然后用1％BSA封闭溶液对...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟晨，李梦瑶，王书雅，杨悠悠，谢云峰，
申请(专利权)人：中粮营养健康研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：