一株嵌合犬瘟热病毒株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及疫苗技术领域，公开了一株嵌合犬瘟热病毒株及其构建方法和应用。本发明专利技术所述嵌合犬瘟热病毒株以狐源犬瘟热病毒强毒HBF‑1株为基础，将其H基因替换为犬瘟热病毒疫苗株Onderstepoort的H基因。本发明专利技术利用反向遗传操作系统，将狐源犬瘟热病毒强毒HBF‑1的H基因替换为疫苗毒Onderstepoort的H基因，通过病毒拯救获得了一株嵌合犬瘟热病毒株rHBF‑vacH，该病毒可在Vero‑dSlam中稳定传代，且病毒滴度稳定达到10

【技术实现步骤摘要】
一株嵌合犬瘟热病毒株及其构建方法和应用
本专利技术涉及疫苗
，具体的说是涉及一株嵌合犬瘟热病毒株及其构建方法和应用。
技术介绍
犬瘟热弱毒活疫苗的广泛应用已经半个多世纪，防控效果虽然不错，但近年来仍然出现了多起动物感染犬瘟热发生死亡的报道。疫苗产品用的犬瘟热病毒(Caninedistempervirus,CDV)毒株，是通过连续鸡胚和细胞系传代致弱获得的，其基因型属于美洲I型。我国犬瘟热病毒流行毒株主要是亚洲I型，并呈现多基因型流行特征。犬瘟热病毒疫苗毒株Onderstepoort的H蛋白C末端提早出现了终止密码子，共编码氨基酸604个。犬瘟热病毒强毒株HBF-1的H蛋白则编码607个氨基酸。2010年BevanSawatsky和VeronikavonMessling构建了将强毒株CDV5804的H基因替换为onderstepoortH基因的重组病毒5804P-HOL，发现此重组病毒完全减毒，其最高滴度与亲本强毒CDV5804的基本一致。如果能够获得稳定传代且保持较高病毒滴度的犬瘟热病毒株，未来应用于疫苗开发将会具有极大优势。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一株嵌合犬瘟热病毒株及其构建方法，使得所述嵌合犬瘟热病毒株能够稳定传代并具备较高的病毒滴度；本专利技术的另外一个目的在于提供上述嵌合犬瘟热病毒株在制备疫苗中的应用。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一株嵌合犬瘟热病毒株，以狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株为基础，将其H基因替换为犬瘟热病毒疫苗株Onderstepoort的H基因。为了方便犬瘟热病毒疫苗株Onderstepoort的H基因的替换，本专利技术首先通过狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株(以下简写为HBF-1或wtHBF-1)的反向遗传系统构建其重组狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株(以下简写为rHBF-1)，具体操作如下：以HBF-1株总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增获得表达HBF-1株N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、H蛋白和L蛋白的序列，将这些序列顺次拼接、插入到真核表达载体中，获得HBF-1株的全长cDNA重组质粒，同时构建表达HBF-1株N、P、L蛋白的三个辅助质粒，与全长cDNA重组质粒一起转染细胞进行病毒拯救，获得rHBF-1株。与HBF-1株比，rHBF-1株的基因组中会多出一个或多个酶切位点(根据选择的载体确定)，其他方面均与HBF-1相同。作为优选，所述表达载体为市售载体pcDNA3.1(质粒图谱见图1)或经由pcDNA3.1改造多克隆位点而获得的pcDNA3.2(质粒图谱见图2)；所述HBF-1株N、P、L蛋白的三个辅助质粒是指表达HBF-1株N、P、L蛋白的序列插入到载体质粒的多克隆位点形成的质粒；例如HBF-N插入位点为PmeI处；HBF-P插入位点为NotI处；HBF-L插入位点为PmeI处。在本专利技术具体实施方式中，所述反向遗传系统构建过程如下：以适应Vero-dSlam细胞的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株为模板，构建犬瘟热病毒感染性cDNA克隆。获得病毒的全基因组序列后，用RT-PCR方法，分4个长片段(N+P基因序列、M+F基因序列、H基因序列和L基因序列)扩增犬瘟热病毒的全基因组，通过酶切连接和无缝克隆的有机结合，将4个长片段顺次拼接、插入到真核表达载体pcDNA3.2(由pcDNA3.1改造多克隆位点而获得)的多克隆酶切位点处(见图3)。经过酶切鉴定，确定获得狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的全长cDNA重组质粒(pcDNA3.2-HBF-1)，同时构建表达犬瘟热病毒强毒HBF-1株N、P、L蛋白的三个辅助质粒(pcDNA3.1-HBF-N、pcDNA3.1-HBF-P和pcDNA3.1-HBF-L)。经酶切和序列测定鉴定，全长重组质粒pcDNA3.2-HBF-1序列与预期一致。将全长质粒pcDNA3.2-HBF-15μg和三个辅助质粒pcDNA3.1-HBF-N1μg，pcDNA3.1-HBF-P0.8μg和pcDNA3.1-HBF-L0.5μg，转染试剂X-tremeGENEHPDNA22μL，共转染BSR细胞，3天后，将上清接种到Vero-dSlam细胞上，37℃5％CO2培养5-10天，观察到犬瘟热病毒引起的典型合胞体病变。经过RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)，电镜观察鉴定，证实拯救出重组病毒rHBF-1株。在本专利技术具体实施方式中，本专利技术以rHBF-1株为基础，将其H基因替换为犬瘟热病毒疫苗株Onderstepoort的H基因，获得嵌合病毒rHBF-1-vacH；将嵌合病毒rHBF-vacH感染Vero-dSlam细胞，观察到典型细胞病变情况，同时空白对照细胞无病变，用犬瘟热N蛋白单克隆抗体为一抗、FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，进行间接免疫荧光检测。结果显示，发生病变的细胞能与CDVN蛋白单克隆抗体发生特异性结合，发出绿色荧光，呈阳性信号，而空白对照细胞无荧光，为阴性。嵌合病毒rHBF-1-vacH的上清液用于负染，在电子显微镜下观察。结果可见，病毒粒子外部有一层囊膜包裹，囊膜上含有纤突，是副黏病毒的形态特征。此外，嵌合病毒rHBF-1-vacH可在Vero-dSlam细胞上稳定传代，嵌合病毒在第二代时有明显病毒滴度的增高。传到第九代时，病毒滴度最高可稳定达到107.0TCID50/ml，而亲本毒株rHBF-1和野生毒株wtHBF-1的病毒滴度稳定在105.0TCID50/ml。基于上述嵌合病毒的优异性能，本专利技术提出了所述嵌合犬瘟热病毒株在制备犬瘟热病疫苗中的应用。同时，本专利技术还提供一种构建嵌合犬瘟热病毒株的方法，该方法可按照两种不同方式进行，在第一种方式中可直接跳过扩增获得HBF-1株H基因的步骤，直接扩增获得Onderstepoort的H基因，然后构建HBF-vacH全长重组质粒，进而通过病毒拯救获得嵌合病毒；在第二种方式中，首先获得HBF-1株的全长cDNA重组质粒，然后通过酶切方式将HBF-1株的全长cDNA重组质粒上的H基因替换为Onderstepoort的H基因，构建出HBF-vacH全长重组质粒(图4)，进而通过病毒拯救获得嵌合病毒；具体地，第一种方式方法如下：步骤1、以狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增获得表达狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白和L蛋白的序列；以犬瘟热病毒疫苗株Onderstepoort总RNA为模板，用RT-PCR方法获得表达犬瘟热病毒疫苗株Onderstepoort的H蛋白的序列；步骤2、将步骤1获得的表达N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、H蛋白和L蛋白的序列顺次拼接、插入到真核表达载体中，获得替换为OnderstepoortH基因的HBF-vacH全长重组质粒；步骤3、HBF-vacH全长重组质粒与表达狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株N、P、L蛋白的三个辅助质粒一起转染细胞进行病毒拯救，获得所述嵌合犬瘟热病毒株。...

【技术保护点】
1.一株嵌合犬瘟热病毒株，其特征在于，以狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株为基础，将其H基因替换为犬瘟热病毒疫苗株Onderstepoort的H基因。/n

【技术特征摘要】
1.一株嵌合犬瘟热病毒株，其特征在于，以狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株为基础，将其H基因替换为犬瘟热病毒疫苗株Onderstepoort的H基因。


2.根据权利要求1所述嵌合犬瘟热病毒株，其特征在于，所述狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株是以狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株为模板通过反向遗传系统构建的重组狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株。


3.根据权利要求2所述嵌合犬瘟热病毒株，其特征在于，所述重组狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的构建方法如下：
以狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增获得表达狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、H蛋白和L蛋白的序列，将这些序列顺次拼接、插入到真核表达载体中，获得狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的全长cDNA重组质粒，同时构建表达狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株N、P、L蛋白的三个辅助质粒，与全长cDNA重组质粒一起转染细胞进行病毒拯救，获得重组狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株。


4.权利要求1-3任意一项所述嵌合犬瘟热病毒株在制备犬瘟热病疫苗中的应用。


5.一种构建嵌合犬瘟热病毒株的方法，其特征在于，包括：
步骤1、以狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增获得表达狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白和L蛋白的序列；
以犬瘟热病毒疫苗株Onderstepoort总R...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛向红，闫喜军，卜研，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22