含有蛋白酶抑制物的组合物、包含前者的组合物和用于产生和使用前者的方法技术

本发明专利技术提供了用于口服施用治疗性蛋白的方法和组合物、改善的蛋白酶抑制物制备物，用于产生前者的方法，和包含前者的组合物。

【技术实现步骤摘要】
含有蛋白酶抑制物的组合物、包含前者的组合物和用于产生和使用前者的方法本申请是申请日为2013年1月31日、申请号为201380018355.7、专利技术名称为“含有蛋白酶抑制物的组合物、包含前者的组合物和用于产生和使用前者的方法”的分案申请。本申请要求2012年2月1日提交的美国临时申请61/632,868和2012年3月6日提交的美国临时申请61/634,753的权益，所述文献通过引用方式完整并入本文。
本申请提供了用于口服施用治疗性蛋白的方法和组合物、改善的蛋白酶抑制物制备物，用于产生所述组合物的方法，和包含所述组合物的组合物。
技术介绍
基于蛋白质/肽的药物一般易在胃肠道中降解和/或不被从小肠以生物活性形式有效吸收到血流中。正在开发用于基于蛋白质的药物(如胰岛素)的口服递送制剂(Ziv等人,1994；Nissan等人,2000，Kidron等人,2004，Eldor等人,2010A，Eldor等人,2010B)。一种此类口服胰岛素产品安排了II期试验的测试并且目前正在就IND状态评审。源自大豆(Glycinemax)的胰蛋白酶抑制物可容易获得并且认为它们对人类消费是安全的。所述胰蛋白酶抑制物包括由抑制胰蛋白酶的KTI(Kunitz胰蛋白酶抑制物)和抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的BBI(Bowman-Birk抑制物)组成的SBTI(大豆胰蛋白酶抑制蛋物)。这类胰蛋白酶抑制物可获自，例如美国Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.。用于制备BBI的方法描述在，例如US7,404,973中。专利技术概述专利技术人已经发现在药物组合物中使用时，市售SBTI制备物产生高度可变的结果。据推测，KTI和BBI的活性应当是各自优化的，以改善药物组合物的活性。为此目的，从商业来源获得SBTI作为KTI和BBI的独立制备物。但是，发现这些制备物均遭受另一种活性污染。使问题复杂化的是，发现制备物，特别是在大规模制备物中，BBI活性存在明显变异性，这一点通过防止肠道酶降解蛋白质(例如胰岛素)的可变能力得到印证。因此，根据本申请描述的某些实施方案，开发了纯化SBTI的改进方法，其中将每种产物按其自身规格制备达到高水平活性，并且使高分子量(MW)杂质的水平最小化。根据其他实施方案，该方法避免使用PEG和第二色谱步骤并且以较高产率为特征。根据其他实施方案，该产物特别合适用于药物组合物(例如口服施用治疗性蛋白的组合物)中。此外，根据其他实施方案，KTI活动和BBI活性的完全分离允许更精确调节包含治疗性蛋白和BBI和/或KTI的药物组合物的抗胰蛋白酶活性和抗胰凝乳蛋白酶活性，从而获得药物组合物的更稳健和/或可重复更高的体内活性。进一步发现需要乳化剂以便利地制备含有肽/蛋白质的药物的大规模制备物。然而，需要根据经验检验添加特定乳化剂是否可以在不影响制剂的口服功效情况下有效的防止在基于油的制备物中的沉淀。所描述的其他实施方案因此涉及特定乳化剂或乳化剂组合与改进的SBTI一起存在于含有治疗性肽和治疗性蛋白质的基于油的药物组合物中。术语“蛋白质”和“肽”在本文中互换使用。除非明确地指出限制，否则这两种术语的任一个均不旨在对存在的氨基酸的数目加以限制。附图说明以下图是说明性例子并且不意在视为限制要求保护的专利技术。图1.SBTI纯化的流程图。A.SBTI中间生产。B.产生BBI和KTI的下游纯化。图2.DEAE琼脂糖凝胶TM(SepharoseTM)柱分离的色谱图。在DEAE柱洗脱期间收集0.3L级分。图3.纯化的BBI和KTI的SDS-PAGE分析。进行电泳，扫描凝胶，并且使用ImageScannerTMIII和ImageQuantTMTL(二者均来自GeneralElectric)定量条带。将每毫升1毫克(mg/ml)的样品加载于20％PhastgelTM上。泳道1：对照(老旧SBTI制备物)。泳道2：纯化的KTI，条带量＝100％。泳道3：纯化的BBI，下部条带量＝89.2％，上部条带量＝10.8％。图4.使用改进的流程的小规模柱层析运行报道。方框、圆圈和三角形分别表示电导率曲线、pH和OD280。垂直轴：电导率曲线(毫西门子)、pH和OD280(任意单位)。水平轴：柱体积和级分编号。图5.来自图4中所示层析的级分的20％SDS-PAGE。A.从左至右显示级分4-18和汇集的级分5-11。“C”指现有技术的胰蛋白酶抑制物(Sigma-Aldrich目录号T9003)。B.从右至左显示级分6-15，包括洗液+通流物(flowthrough)(W+FT)和标准物(来自大豆(Glycinemax)的胰蛋白酶抑制物；“ST”)。图6.仅额外纯化BBI的步骤的SDS-PAGE分析。ST＝标准物(见图5图注)，2mg/ml。泳道：1：来自柱的BBI汇集物。2：30KDa过滤的渗透物。3：1:40稀释的30KDa过滤的截留物质。4：1:4稀释的5KDa浓缩的截留物质。图7.仅纯化BBI的1mg/ml终产物的SDS-PAGE分析。ST＝标准物(见图5图注)，1mg/ml。图8.下游纯化BBI和KTI的改进方案的流程图。图9.使用替代工序的柱层析运行报告。图10.相对于标准物(通道3)，使用替代工序(泳道1-2)纯化的BBI的两份重复样品与标准物(泳道3)的SDS-PAGE分析。图11.各种乳化剂制剂的检验结果。泡沫形成评分为1-5，其中1表示无泡沫，5表示因泡沫而见不到液体。对于混悬试验，数字1-5分别表示完全相分离；具有一些较大油泡的部分相分离；小油泡，乳状稠度；起初无泡，稍后相分离；和稳定乳液。图12.施用含有多种乳化剂的口服胰岛素制剂后的血糖曲线。A.制剂A(左上)、B(左下)、C(右上)和D(右下)。B.制剂E(左)和F(右)。图13.患者记录薄。A.血糖记录。B.调查问卷。图14.低血糖评审薄。对记录的低血糖的每次出现给予分数，同时根据经受的神经低血糖症状或缺少神经低血糖症状给予额外的评分。症状的定义的例子如下：视觉，眼不能凝视、视力受损、复视；行为，不能睡眠、易怒、压力大、神经、“喜卧懒动(wanttositdownanddonothing)”；其他神经学，头晕、眩晕、虚弱、疲劳、犯困、行走或说话困难、反应迟缓、运动技巧迟缓、丧失平衡；意识模糊，不能进行简单算术、感觉“寂寞”。即便也存在一些神经低血糖症状，但如果存在充分警示即将发生低血糖的自主症状，则不给予分数。对需要外部帮助以确认或处理这个事件，给予额外分数。图15.用各种剂量口服胰岛素治疗的受试者中的葡萄糖反应。实施方案的具体描述在一个方面，提供从大豆产品分离的BBI，根据在多种实施方案中通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、亮蓝染色或成像仪定量法的测量，其中所述BBI是至少85％纯的。在某些实施方案中，大豆产品是大豆粉。在又一个方面，提供从大豆粉分离的BBI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含基于油的液态制剂的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂包含达100千道尔顿的治疗性蛋白、二价阳离子的螯合剂和分离的BBI。/n

【技术特征摘要】
20120201 US 61/632,868;20120306 US 61/634,7531.包含基于油的液态制剂的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂包含达100千道尔顿的治疗性蛋白、二价阳离子的螯合剂和分离的BBI。


2.根据权利要求1所述的口服药物组合物，其中，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测量，所述BBI已经纯化到至少85％的纯度。


3.根据权利要求1所述的口服药物组合物，其中，通过BCA(二羧基二喹啉)的测定法，所述BBI已经纯化到大于95％的蛋白质含量。


4.根据权利要求1所述的口服药物组合物，其中，所述BBI含有小于0.1％高分子量杂质。


5.根据权利要求1所述的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂还包含不同于所述BBI的胰蛋白酶抑制物。


6.根据权利要求5所述的口服药物组合物，其中，所述胰蛋白酶抑制物是KTI3。


7.根据权利要求6所述的口服药物组合物，其中，通过SDS-PAGE测量，所述KTI3已经纯化到至少85％的纯度。


8.根据权利要求6所述的口服药物组合物，其中，所述KTI3已经纯化到通过BCA测定法所测量的大于95％的蛋白质含量。


9.根据权利要求6所述的口服药物组合物，其中，所述KTI3含有小于0.1％高分子量杂质。


10.包含基于油的液态制剂的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂包含达100千道尔顿的治疗性蛋白和二价阳离子的螯合剂，并且所述液态制剂具有抑制至少40mg胰凝乳蛋白酶/ml液态制剂的抗胰凝乳蛋白酶活性。


11.根据权利要求10所述的口服药物组合物，其中，所述液态制剂还包含抑制至少20mg胰蛋白酶/ml液态制剂的抗胰蛋白酶活性。


12.根据权利要求1-11中任一项所述的口服药物组合物，其中，所述治疗性蛋白选自：胰岛素、流感血凝素、流感神经氨酸酶、胰高血糖素、干扰素γ、干扰素β、干扰素α、生长激素、促红细胞生成素、GLP-1、GLP-1类似物、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肾素、生长激素释放因子、甲状旁腺激素、促甲状腺激素、促卵泡激素、降钙素、促黄体激素、胰高血糖素、凝血因子、抗凝血因子、心钠素、表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白B(SP-B)、表面活性蛋白C(SP-C)、表面活性蛋白D(SP-D)、纤维蛋白溶酶原激活物、铃蟾肽、造血生长因子(集落刺激因子，多种)、肿瘤坏死因子(TNF)蛋白、脑啡肽酶、RANTES(活化时受调节，通常是T-细胞表达和分泌)、人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)、血清白蛋白、缪勒管抑制物质、松弛素、小鼠促性腺素释放激素、DNA酶、抑制素、活化素、血管内皮生长因子(VEGF)、神经营养因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-5或神经营养蛋白-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、神经生长因子、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II(IGF-I和IGF-II)、des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5、IGFBP-6、角质形成细胞生长因子、骨诱导因子、骨形态发生蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚伯拉罕·赫斯赫克，米丽娅姆·基德隆，
申请(专利权)人：奥拉姆德有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列;IL