含有蛋白酶抑制物的组合物、包含前者的组合物和用于产生和使用前者的方法技术

本发明专利技术提供了用于口服施用治疗性蛋白的方法和组合物、改善的蛋白酶抑制物制备物，用于产生前者的方法，和包含前者的组合物。和包含前者的组合物。和包含前者的组合物。

【技术实现步骤摘要】
含有蛋白酶抑制物的组合物、包含前者的组合物和用于产生和使用前者的方法
[0001]本申请是申请日为2013年1月31日、申请号为201380018355.7、专利技术 名称为“含有蛋白酶抑制物的组合物、包含前者的组合物和用于产生和使用 前者的方法”的分案申请。
[0002]本申请要求2012年2月1日提交的美国临时申请61/632,868和2012年 3月6日提交的美国临时申请61/634,753的权益，所述文献通过引用方式完 整并入本文。


[0003]本申请提供了用于口服施用治疗性蛋白的方法和组合物、改善的蛋白酶 抑制物制备物，用于产生所述组合物的方法，和包含所述组合物的组合物。

技术介绍

[0004]基于蛋白质/肽的药物一般易在胃肠道中降解和/或不被从小肠以生物活 性形式有效吸收到血流中。正在开发用于基于蛋白质的药物(如胰岛素)的口服 递送制剂(Ziv等人,1994；Nissan等人,2000，Kidron等人,2004，Eldor等人, 2010A，Eldor等人,2010B)。一种此类口服胰岛素产品安排了II期试验的测 试并且目前正在就IND状态评审。
[0005]源自大豆(Glycine max)的胰蛋白酶抑制物可容易获得并且认为它们对人 类消费是安全的。所述胰蛋白酶抑制物包括由抑制胰蛋白酶的KTI(Kunitz胰 蛋白酶抑制物)和抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的BBI(Bowman
‑
Birk抑制物) 组成的SBTI(大豆胰蛋白酶抑制蛋物)。这类胰蛋白酶抑制物可获自，例如美 国Sigma
‑
Aldrich,St.Louis,Mo.。用于制备BBI的方法描述在，例如 US7,404,973中。

技术实现思路

[0006]专利技术人已经发现在药物组合物中使用时，市售SBTI制备物产生高度可变 的结果。据推测，KTI和BBI的活性应当是各自优化的，以改善药物组合物 的活性。为此目的，从商业来源获得SBTI作为KTI和BBI的独立制备物。 但是，发现这些制备物均遭受另一种活性污染。使问题复杂化的是，发现制 备物，特别是在大规模制备物中，BBI活性存在明显变异性，这一点通过防 止肠道酶降解蛋白质(例如胰岛素)的可变能力得到印证。
[0007]因此，根据本申请描述的某些实施方案，开发了纯化SBTI的改进方法， 其中将每种产物按其自身规格制备达到高水平活性，并且使高分子量(MW) 杂质的水平最小化。根据其他实施方案，该方法避免使用PEG和第二色谱步 骤并且以较高产率为特征。根据其他实施方案，该产物特别合适用于药物组 合物(例如口服施用治疗性蛋白的组合物)中。此外，根据其他实施方案，KTI 活动和BBI活性的完全分离允许更精确调节包含治疗性蛋白和BBI和/或KTI 的药物组合物的抗胰蛋白酶活性和抗胰凝乳蛋白酶活性，从而获得药物组合 物的更稳健和/或可重复更高的体内活性。
[0008]进一步发现需要乳化剂以便利地制备含有肽/蛋白质的药物的大规模制 备物。然而，需要根据经验检验添加特定乳化剂是否可以在不影响制剂的口 服功效情况下有效的
防止在基于油的制备物中的沉淀。所描述的其他实施方 案因此涉及特定乳化剂或乳化剂组合与改进的SBTI一起存在于含有治疗性 肽和治疗性蛋白质的基于油的药物组合物中。
[0009]术语“蛋白质”和“肽”在本文中互换使用。除非明确地指出限制，否则这 两种术语的任一个均不旨在对存在的氨基酸的数目加以限制。
附图说明
[0010]以下图是说明性例子并且不意在视为限制要求保护的专利技术。
[0011]图1.SBTI纯化的流程图。A.SBTI中间生产。B.产生BBI和KTI的下 游纯化。
[0012]图2.DEAE琼脂糖凝胶
TM
(Sepharose
TM
)柱分离的色谱图。在DEAE 柱洗脱期间收集0.3L级分。
[0013]图3.纯化的BBI和KTI的SDS
‑
PAGE分析。进行电泳，扫描凝胶，并 且使用ImageScanner
TM III和ImageQuant
TM TL(二者均来自General Electric) 定量条带。将每毫升1毫克(mg/ml)的样品加载于20％Phastgel
TM
上。泳道1： 对照(老旧SBTI制备物)。泳道2：纯化的KTI，条带量＝100％。泳道3：纯化 的BBI，下部条带量＝89.2％，上部条带量＝10.8％。
[0014]图4.使用改进的流程的小规模柱层析运行报道。方框、圆圈和三角形分 别表示电导率曲线、pH和OD
280
。垂直轴：电导率曲线(毫西门子)、pH和 OD
280
(任意单位)。水平轴：柱体积和级分编号。
[0015]图5.来自图4中所示层析的级分的20％SDS
‑
PAGE。A.从左至右显示 级分4
‑
18和汇集的级分5
‑
11。“C”指现有技术的胰蛋白酶抑制物 (Sigma
‑
Aldrich目录号T9003)。B.从右至左显示级分6
‑
15，包括洗液+通流 物(flowthrough)(W+FT)和标准物(来自大豆(Glycine max)的胰蛋白酶抑制物；
ꢀ“
ST”)。
[0016]图6.仅额外纯化BBI的步骤的SDS
‑
PAGE分析。ST＝标准物(见图5 图注)，2mg/ml。泳道：1：来自柱的BBI汇集物。2：30KDa过滤的渗透物。 3：1:40稀释的30KDa过滤的截留物质。4：1:4稀释的5KDa浓缩的截留物 质。
[0017]图7.仅纯化BBI的1mg/ml终产物的SDS
‑
PAGE分析。ST＝标准物(见 图5图注)，1mg/ml。
[0018]图8.下游纯化BBI和KTI的改进方案的流程图。
[0019]图9.使用替代工序的柱层析运行报告。
[0020]图10.相对于标准物(通道3)，使用替代工序(泳道1
‑
2)纯化的BBI的两 份重复样品与标准物(泳道3)的SDS
‑
PAGE分析。
[0021]图11.各种乳化剂制剂的检验结果。泡沫形成评分为1
‑
5，其中1表示无 泡沫，5表示因泡沫而见不到液体。对于混悬试验，数字1
‑
5分别表示完全 相分离；具有一些较大油泡的部分相分离；小油泡，乳状稠度；起初无泡， 稍后相分离；和稳定乳液。
[0022]图12.施用含有多种乳化剂的口服胰岛素制剂后的血糖曲线。A.制剂A (左上)、B(左下)、C(右上)和D(右下)。B.制剂E(左)和F(右)。
[0023]图13.患者记录薄。A.血糖记录。B.调查问卷。
[0024]图14.低血糖评审薄。对记录的低血糖的每次出现给予分数，同时根据本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.包含基于油的液态制剂的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂包含达100千道尔顿的治疗性蛋白、二价阳离子的螯合剂和分离的BBI。2.根据权利要求1所述的口服药物组合物，其中，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS
‑
PAGE)测量，所述BBI已经纯化到至少85％的纯度。3.根据权利要求1所述的口服药物组合物，其中，通过BCA(二羧基二喹啉)的测定法，所述BBI已经纯化到大于95％的蛋白质含量。4.根据权利要求1所述的口服药物组合物，其中，所述BBI含有小于0.1％高分子量杂质。5.根据权利要求1所述的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂还包含不同于所述BBI的胰蛋白酶抑制物。6.根据权利要求5所述的口服药物组合物，其中，所述胰蛋白酶抑制物是KTI3。7.根据权利要求6所述的口服药物组合物，其中，通过SDS
‑
PAGE测量，所述KTI3已经纯化到至少85％的纯度。8.根据权利要求6所述的口服药物组合物，其中，所述KTI3已经纯化到通过BCA测定法所测量的大于95％的蛋白质含量。9.根据权利要求6所述的口服药物组合物，其中，所述KTI3含有小于0.1％高分子量杂质。10.包含基于油的液态制剂的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂包含达100千道尔顿的治疗性蛋白和二价阳离子的螯合剂，并且所述液态制剂具有抑制至少40mg胰凝乳蛋白酶/ml液态制剂的抗胰凝乳蛋白酶活性。11.根据权利要求10所述的口服药物组合物，其中，所述液态制剂还包含抑制至少20mg胰蛋白酶/ml液态制剂的抗胰蛋白酶活性。12.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的口服药物组合物，其中，所述治疗性蛋白选自：胰岛素、流感血凝素、流感神经氨酸酶、胰高血糖素、干扰素γ、干扰素β、干扰素α、生长激素、促红细胞生成素、GLP
‑
1、GLP
‑
1类似物、粒细胞集落刺激因子(G
‑
CSF)、肾素、生长激素释放因子、甲状旁腺激素、促甲状腺激素、促卵泡激素、降钙素、促黄体激素、胰高血糖素、凝血因子、抗凝血因子、心钠素、表面活性蛋白A(SP
‑
A)、表面活性蛋白B(SP
‑
B)、表面活性蛋白C(SP
‑
C)、表面活性蛋白D(SP
‑
D)、纤维蛋白溶酶原激活物、铃蟾肽、造血生长因子(集落刺激因子，多种)、肿瘤坏死因子(TNF)蛋白、脑啡肽酶、RANTES(活化时受调节，通常是T
‑
细胞表达和分泌)、人巨噬细胞炎性蛋白(MIP
‑1‑
α)、血清白蛋白、缪勒管抑制物质、松弛素、小鼠促性腺素释放激素、DNA酶、抑制素、活化素、血管内皮生长因子(VEGF)、神经营养因子、神经营养蛋白
‑
3、神经营养蛋白
‑
4、神经营养蛋白
‑
5或神经营养蛋白
‑
6(NT
‑
3、NT
‑
4、NT
‑
5或NT
‑
6)、神经生长因子、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子
‑
I和胰岛素样生长因子
‑
II(IGF
‑
I和IGF
‑
II)、des(1
‑
3)
‑
IGF
‑
I(脑IGF
‑
I)、胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP
‑
1)、IGFBP
‑
2、IGFBP
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚伯拉罕，
申请(专利权)人：奥拉姆德有限公司，
类型：发明
国别省市：