重组人源化胶原蛋白及其产业化制备方法与产品应用技术

本发明专利技术涉及一种重组人源化胶原蛋白及其产业化制备方法与产品应用。本发明专利技术提供了一种衍生自人I型胶原蛋白的人源化胶原蛋白(rHLC)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，该序列可以作为核心单元进行3‑25个重复串联形成一系列不同分子量的人源化胶原蛋白分子。本发明专利技术的人源化胶原蛋白设计的rHLC分子序列来自于人I型胶原蛋白，具有极大的水溶性和亲水性，同时具有良好的保湿性、吸湿性和生物相容性，并且促增殖作用显著；设计的rHLC分子在大肠杆菌宿主内可以高效的表达，产量达到0.5g/L～1.5g/L；rHLC的发酵工艺培养基成本低廉成分明确，发酵周期较短，控制简单，易于工艺放大；开发的rHLC纯化方法操作简单，成本低，效果好，工艺稳定，纯化后的纯品纯度、内毒素、HCP、DNA残留等可以满足药用标准，生产工艺可满足产业化生产需求，可应用于医美类化妆品或者功能性化妆品。

【技术实现步骤摘要】
重组人源化胶原蛋白及其产业化制备方法与产品应用
本专利技术属于基因工程、蛋白纯化领域，具体涉及一种重组人源化胶原蛋白分子(recombinanthumanlikecollagen，简称rHLC)的表达及纯化制备方法。
技术介绍
胶原蛋白是人体中含量最为丰富的蛋白质，占人体总蛋白质的25-30％，主要存在于人体的皮肤、骨骼、软骨、牙齿、肌腱、韧带，是结缔组织中极其重要的结构蛋白质，起着支撑器官，保护机体的功能。胶原蛋白种类很多，常见的类型包括：I型、II型、III型、V型和XI型，其中I型胶原蛋白主要存在于皮肤、肌腱等组织中，是含量最多的胶原蛋白类型。胶原蛋白具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性(促进伤口恢复、凝血等)，因此在食品、医疗、组织工程、化妆品中有着非常广泛的应用。目前应用最为广泛的胶原蛋白是I型胶原蛋白。目前应用的胶原蛋白主要来自于动物组织的提取或人胶原(胎盘组织提取、骨骼等)，其中通过动物组织提取胶原是最主要的手段，成本也较低，但是通过该方法获得的胶原蛋白一般水溶性较差、具有潜在的病毒传染性风险、免疫原性较高、胶原产品质量控制难度高等缺点。通过基因工程的手段制备人源化胶原蛋白分子则可以规避这些缺点，但是天然的胶原蛋白分子过大，无法或很难通过基因工程手段直接生产，而通过生产与天然胶原蛋白序列相似、分子量更小的人源化胶原蛋白分子则是在技术上更为可行。市场上已有一些重组胶原蛋白产品，而现有的产品都是针对各自产品特点需要，在人胶原蛋白序列的基础上进行重新构建设计的，但这些设计并不能满足极大的水溶性和亲水性、良好的保湿性和吸湿性等特殊性能需求，同时还需要满足产业化制备的需要。
技术实现思路
为了克服上述技术问题，本专利技术提供了一种全新设计的重组人源化胶原蛋白分子(recombinanthumanlikecollagen，简称rHLC)的表达及纯化制备方法。具体涉及到：1、rHLC的分子设计以及重组大肠杆菌表达菌株的构建；2、rHLC发酵工艺开发；3、rHLC纯化工艺开发。本专利技术所设计的人源化胶原蛋白分子在大肠杆菌宿主内具有较高的产量，并且确定了简单方法获得高品质纯品的工艺。本专利技术目的之一在于提供一种衍生自人I型胶原蛋白的人源化胶原蛋白序列，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，命名为RepA。该序列可以作为核心单元进行重复串联形成一系列不同分子量的人源化胶原蛋白分子，优选的重复个数包括3-25个，更优选为10-20，最优选10-15个。不同重复个数的部分信息如下表：本专利技术目的之二在于提供一种用于携带和表达所述重组人源化胶原蛋白基因的表达载体，所述载体应具备较强的转录启动子、较高的拷贝数等特点，如常见的pET载体等。本专利技术目的之三在于提供一种用于所述rHLC重组表达质粒表达的宿主，如BL21(DE3)、BL21AI、Rosetta(DE3)、Transetta(DE3)等。本专利技术之四在于提供一种表达rHLC大肠杆菌的发酵表达方法，该方法包括：发酵种子活化、发酵种子液制备、发酵。所述的发酵包括如下步骤：将种子液按照1-10％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中；设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-45％之间；发酵开始后定期取样进行OD600和菌体湿重的测定，待OD600达到30左右时，开始进行补料培养；待菌体生长至0D600≈20-55之间向发酵罐中加入终浓度为0.2-1.0mM的IPTG进行诱导表达；诱导表达4-6h结束培养。本专利技术目的之五在于提供一种rHLC蛋白粗纯方法，该方法可以有效的将rHLC从大肠杆菌胞内释放，经过简单的纯化步骤即可获得纯度70％以上的蛋白粗品。包括：发酵菌体使用TE缓冲液(20mMTrisHCl1mMEDTApH8.0)重悬至100-150g/L→悬浮物使用高压均质机裂解，离心收集裂解物上清，上清过滤去除不溶物杂质→上清中加入终浓度为30-150mM硫酸锰，搅拌均匀后离心收集上清→上一步硫酸锰处理后上清使用柠檬酸调节pH至4.5，搅拌均匀后离心收集上清，上清过滤→将pH处理后上清加入硫酸铵颗粒盐析至终浓度达到0.8-1.2M，离心收集盐析沉淀→盐析沉淀使用纯化水溶解(1L水对1kg初始湿菌体)2h以上，离心收集上清并过滤除去颗粒或絮状杂质，将该上清放入到0-8℃内维持12h以上，此时蛋白析出，低温离心收集沉淀即可获得粗品。本专利技术的目的之六在于提供一种rHLC粗蛋白的层析精制纯化方法，具体包括：将rHLC粗品使用pH6.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解至浓度1-50mg/ml，过滤去除杂质获得粗品溶液→将粗纯液使用SPFF纯化。通过该方法可制备高纯度的rHLC。本专利技术的目的之七在于提供上述rHLC在制备医美类化妆品或者功能性化妆品中的应用。本专利技术的主要优点在于：1、设计的rHLC分子序列来自于人I型胶原蛋白，具有极大的水溶性(溶解度达20％以上)和亲水性，同时具有良好的保湿性、吸湿性和生物相容性，并且促增殖作用显著。可应用于医美类化妆品或者功能性化妆品。2、设计的rHLC分子在大肠杆菌宿主内可以高效的表达，产量达到0.5g/L～1.5g/L，易于进行放大。3、rHLC的发酵工艺培养基成本低廉成分明确，发酵周期较短，控制简单。4、开发的rHLC纯化方法操作简单，成本低，效果好，易于放大和重复，纯化后的纯品纯度、内毒素、HCP、DNA残留等可以满足药用标准，整个生产工艺可满足产业化生产需求。附图说明图1中：图1-a：M：分子量标准，lane1-3：RepA3表达鉴定图1-b：M：分子量标准，lane1：RepA5表达鉴定图1-c：M：分子量标准，lane1：RepA10表达鉴定图1-d：M：分子量标准，lane1：RepA15表达鉴定图1-e：M：分子量标准，lane1：RepA20表达鉴定图1-f：M：分子量标准，lane1-2：RepA25表达鉴定图2中：图2-a(RepA3)：M：分子量标准，lane1-6：裂解物上清、硫酸锰处理后上清、硫酸锰处理后沉淀、pH4.5处理后上清、pH4.5处理后沉淀、盐析沉淀图2-b(RepA5)：M：分子量标准，lane1-8：裂解物上清、裂解物沉淀、硫酸锰处理后上清、硫酸锰处理后沉淀、pH4.5处理后上清、pH4.5处理后沉淀、盐析上清、盐析沉淀图2-c(RepA10)：M：分子量标准，lane1-4：硫酸锰处理后上清、pH4.5处理后上清、盐析上清、盐析沉淀图2-d(RepA15)：M：分子量标准，lane1-7：裂解物上清、硫酸锰处理后上清、pH4.5处理后上清、盐析上清、盐析沉淀、盐析沉淀纯水复溶上清、盐析沉淀纯水复溶后不溶物图2-e(RepA20)：M：分子量标准，lane1-6：裂解物上清、硫酸锰处理后上清、pH4.5处理后上清、pH4.5处理后沉淀、盐析上清本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源化胶原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
20191031 CN 20191104848501.一种人源化胶原蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.一种人源化胶原蛋白，其氨基酸序列由3-25个核心单元进行重复串联形成，所述核心单元的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。


3.如权利要求2所述的人源化胶原蛋白，其氨基酸序列由10-20个核心单元进行重复串联形成，所述核心单元的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。


4.如权利要求2所述的人源化胶原蛋白，其氨基酸序列由10-15个核心单元进行重复串联形成，所述核心单元的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。


5.一种用于携带和表达如权利要求1至4中任一项的人源化胶原蛋白基因的表达载体或菌株，所述载体为pET载体，所述菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。


6.一种表达人源化胶原蛋白的方法，该方法包括：发酵种子活化、发酵种子液制备、发酵。所述的发酵包括如下步骤：
将如权利要求5所述菌株的种子液按照1-10％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中；
设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-45％之间；
发酵开始后...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，赵百学，王安良，
申请(专利权)人：江苏京森生物医药新材料科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32