重组蜘蛛丝蛋白及其制备方法和产业化应用技术

本发明专利技术公开了一类重组蜘蛛丝蛋白系列，及其编码基因、表达、纯化方法，以及所述重组蛛丝蛋白系列在缝合线、生物修复膜、止血材料等生物材料方面的应用。本发明专利技术的重组蜘蛛丝蛋白系列，其由N末端非重复区域(N‑NRT)、核心重复区域(REP)、C末端非重复区域(C‑NRT)组成，其中核心重复区域由1‑30个RepA和/或1‑15个RepB组成，单个RepA氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，单个RepB氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术设计的一系列新型的原核系统可溶表达的蛛丝蛋白，具有较高的发酵产量和蛋白纯度，以该蛛丝蛋白系列经过简单的静纺或湿纺工艺制备的蛛丝膜、蛛丝纤维分别具有2.5‑6MPa、40‑280MPa的力学强度，且显示出良好的细胞相容性和止血性能，具备医疗领域产业化应用的前景。

【技术实现步骤摘要】
重组蜘蛛丝蛋白及其制备方法和产业化应用
本专利技术涉及一类重组蜘蛛丝蛋白系列，及其编码基因、表达、纯化方法，以及所述重组蛛丝蛋白系列在成丝、成纳米膜等医用制品方面的应用。
技术介绍
蜘蛛丝既有钢般的坚硬，又有橡胶般的弹性。其突出的性能主要表现在：高强度、高弹性、高断裂功，可以说是迄今为止最强韧的材料，被誉为“生物钢”。随着对蜘蛛丝的研究深入，发现蜘蛛丝还具有生物可降解性、超收缩性、耐高温、耐低温及与生物组织的相容性等特性。由于蜘蛛丝这些独特的物理和生物学特性，它在医学、材料、军事和纺织等方面都有着广泛的应用前景。瑞典科学家JanJohansson利用无刺激性化学物质制造出的人工蜘蛛丝具有良好的生物相容性，可应用于脊髓修复或帮助干细胞生长来修复损伤的心脏组织等再生医学研究中，亦可用于自身防护用具等纺织工业应用中(NatureChemicalBiology,DOI:10.1038/nchembio.2269)。鉴于蜘蛛丝蛋白巨大的潜在应用性，国内外学者加强对蜘蛛丝的研究，希望蜘蛛丝能够像蚕丝那样大规模地应用于实际。由于蜘蛛无法驯养和天然蜘蛛丝产量少等原因，惟有通过基因工程手段才能大量获取蜘蛛丝，满足蜘蛛丝潜在的应用需求。目前研究人员可以借助大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，哺乳动物细胞等表达系统进行蜘蛛丝蛋白的生物工程制备。其中，大肠杆菌表达系具有生长快、产量高、生产规模大、成本低、培养条件简单、遗传背景清楚等多重优点，目前被广泛应用于蜘蛛丝蛋白的重组表达研究中。但是，天然蜘蛛丝分子量非常大(>300KDa)，而大肠杆菌表达的外源蛋白大于60KDa时就会出现表达量降低的现象，天然的蜘蛛丝蛋白分子量过大，几乎不可能表达成功。例如：Fahnestock等人就报道了在大肠杆菌中表达了蜘蛛牵引丝蛋白，但发现大于3kb的基因表达效率降低，并有基因删节表达现象。研究表明，蜘蛛丝蛋白有四种通用的氨基酸模块：(l)GPGXX；(2)GGx；(3)An/(GA)n；(4)间隔区(spacer)。GPGXX(主要是GPGGx和GPGQQ两种形式)是一个五聚肽，主要存在于牵引丝蛋白和鞭毛丝蛋白，形成β成转角结构，一系列的β系转角串联折叠在一起，类似弹簧结构。而这个“弹簧”结构与蜘蛛丝蛋白的弹性相关，蛛丝蛋白弹性的大小与该模块的含量正相关。GGX形成310-螺旋结构，即每三个氨基酸组成一个螺旋。An/(GA)n形成β成片层结构，结构片层之间的分子作用决定了蜘蛛丝蛋白的强度，也是导致蜘蛛丝不溶于水的原因之一。间隔区是一个保守区域，用来间隔富含甘氨酸的区域。总的来说：(l)蜘蛛丝的化学本质是蛋白质；(2)蜘蛛丝蛋白氨基酸序列高度重复性；(3)蜘蛛丝蛋白中含量较多的氨基酸主要为丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；(4)富含聚丙氨酸，形成β成片层刚性结构；(5)脯氨酸形成的β氨转角结构为蜘蛛丝提供良好的弹性。研究人员可以依据上述蜘蛛丝蛋白特性设计重组的蜘蛛丝蛋白，重组蜘蛛丝蛋白一级结构含有上述决定蜘蛛丝蛋白力学性能的模块，并且可以根据不同材料的研发用途进行个性化的序列设计，这样通过人工的序列设计获得的人工蛛丝蛋白不仅具有力学性能可控性而且可以控制蛋白分子量以便实现蛋白在大肠杆菌表达系统中的高效表达。申请人经过研究发现，在既有的蛛丝蛋白设计方案和制备工艺的基础上，虽能满足一般工业领域应用所需，但在医疗制品等领域不仅需要常规的拉力强度，更需要高纯度、低免疫原性等应用需求时却无法满足。
技术实现思路
为克服上述技术问题，本申请专利技术人重新设计了一系列衍生自天然蜘蛛丝的蛋白序列，同时将对应的一系列编码重组蜘蛛丝蛋白序列的基因导入到宿主细胞中进行蛋白表达，并建立高效的重组蜘蛛丝蛋白表达和制备工艺。在此基础上研究了该类重组蜘蛛丝蛋白系列在静电纺丝和湿法纺丝中的应用。本专利技术第一目的在于提供重组蜘蛛丝蛋白，其由N末端非重复区域(N-NRT)、核心重复区域(REP)、C末端非重复区域(C-NRT)组成，其中核心重复区域由1-30个RepA和/或1-15个RepB组成，单个RepA氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，单个RepB氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。RepA和RepB可以以自身串联体或者两者的杂交串联体作为核心重复区。以自身串联体作为核心重复区时，优选含有5-30个RepA作为核心重复区或者含有5-15个RepB作为核心重复区。以两者杂交串联体作为核心重复区时，优选1-5个RepA与1-5个RepB的串联体作为核心重复区。更优选地所述1-5个RepA的串联体位于整个融合蛋白的靠近N端位置，而所述1-5个RepB的串联体位于整个融合蛋白的C端位置。上述N末端非重复区域(N-NRT)，氨基酸序列如SEQIDNO：3所示，C末端非重复区域(C-NRT)，氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。本申请中专利技术人将RepA以5个串联体的形式(RepA5)进行基因合成，同时也将RepB以5个串联体的形式(RepB5)进行基因合成。另外为了便于后续的基因操作，编码RepA5及RepB5的核苷酸的5’端和3’端分别引入了同尾酶酶切位点BamHI和BglII。本专利技术所涉及的部分序列如表1所示：表1所述核苷酸序列均经过针对大肠杆菌表达系统进行密码子优化，从而提高在大肠杆菌中的表达量。上述串联体核苷酸序列可由PCR的方法制备，也可由基因合成的方法制备。本专利技术还提供了包含上述核苷酸序列的表达载体，该载体只要与大肠杆菌表达系统相匹配即可，优选具有拷贝数高、表达效率高的载体，如pET21b、pET28a、pBV220等。本专利技术还提供了包含上述表达载体的大肠杆菌菌株，优选BL21(DE3)、BL21(DE3)plys、Rosetta(DE3)、Transetta(DE3)等。本专利技术还提供了重组蜘蛛丝蛋白高密度发酵生产方法，具体包括：发酵种子活化、发酵一级种子液制备、发酵二级种子制备、高密度发酵，所述高密度发酵具体包括如下步骤：将制备好的二级种子液按照5-15％的接种量接入到含分批发酵培养基的灭菌后的发酵罐中；设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-40％之间；发酵开始后定期取样进行OD600和菌体湿重的测定，待DO曲线出现急剧上升的时候表明分批培养基中葡萄糖耗尽，开始进行补料培养(补料培养基的流加速度维持在8-12g/L/h)；待菌体生长至OD600至40-60之间，使得发酵温度至20-37℃，待温度稳定后向发酵罐中加入终浓度为0.2-1.0mM的IPTG进行诱导表达；诱导表达8-12h结束培养。所述分批发酵培养基成分包括：一水合柠檬酸0.5-3g/L，磷酸二氢钾8-15g/L，磷酸氢二铵3-7g/L，葡萄糖10-20g/L或者含有甘油15-30g/L，七水合硫酸镁1-3g/L。在发酵接种之前还要向分批发酵培养基中加入1/1000(V/V)的微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。所述补料培养基主要成分包括：甘油1024g/L，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组蜘蛛丝蛋白，其氨基酸序列由N末端非重复区域、核心重复区域、C末端非重复区域组成，其中核心重复区域由1-30个RepA和/或1-15个RepB组成，单个RepA氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，单个RepB氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述N末端非重复区域，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述C末端非重复区域，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。/n

【技术特征摘要】
1.重组蜘蛛丝蛋白，其氨基酸序列由N末端非重复区域、核心重复区域、C末端非重复区域组成，其中核心重复区域由1-30个RepA和/或1-15个RepB组成，单个RepA氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，单个RepB氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；所述N末端非重复区域，氨基酸序列如SEQIDNO：3所示；所述C末端非重复区域，氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。


2.根据权利要求1所述的重组蜘蛛丝蛋白，其特征在于：所述核心重复区域由5-30个RepA或5-15个RepB组成。


3.根据权利要求1所述的重组蜘蛛丝蛋白，其特征在于：所述核心重复区域由1-5个RepA和1-5个RepB的串联体组成。


4.根据权利要求3所述的重组蜘蛛丝蛋白，其特征在于：所述1-5个RepA的串联体位于整个融合蛋白的靠近N端位置，所述1-5个RepB的串联体位于整个融合蛋白的C端位置。


5.根据权利要求1至4任一项所述的重组蜘蛛丝蛋白，其特征在于：所述核心重复区域由5个RepA串联体、10个RepA串联体、20个RepA串联体、30个RepA串联体、5个RepB串联体、10个RepB串联体、15个RepB串联体、5个RepA加5个RepB串联体，或...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，赵百学，王安良，孙文秀，江辰阳，
申请(专利权)人：江苏京森生物医药新材料科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32