一种重组蛛丝蛋白的产业化生产方法技术

本发明专利技术涉及一种适用于蛛丝蛋白原核分泌表达放大的生产工艺路线，对工艺中的关键质量参数进行优化，根据优化条件，完成产业化规模放大。本发明专利技术采用的发酵培养基成分简单、成本低廉；发酵工艺中采用特定的控制条件，能耗更低，而表达量提高50％，纯度提高50％。

【技术实现步骤摘要】
一种重组蛛丝蛋白的产业化生产方法
本专利技术属于生物工程领域，涉及重组蛛丝蛋白大肠杆菌分泌表达的产业化生产方法。
技术介绍
蜘蛛丝既有钢般的坚硬,又有橡胶般的弹性。其突出的性能主要表现在:高强度、高弹性、高断裂功,可以说是迄今为止最强韧的材料,被誉为“生物钢”。随着对蜘蛛丝的研究深入,发现蜘蛛丝还具有生物可降解性、超收缩性、耐高温、耐低温及与生物组织的相容性等特性。由于蜘蛛丝这些独特的物理和生物学特性,它在医学、材料、军事和纺织等方面都有着广泛的应用前景。瑞典科学家JanJohansson利用无刺激性化学物质制造出的人工蜘蛛丝具有良好的生物相容性，可应用于脊髓修复或帮助干细胞生长来修复损伤的心脏组织等再生医学研究中，亦可用于自身防护用具等纺织工业应用中(NatureChemicalBiology,DOI:10.1038/nchembio.2269(2017))。鉴于蜘蛛丝蛋白巨大的潜在应用性,国内外学者加强对蜘蛛丝的研究,希望蜘蛛丝能够像蚕丝那样大规模地应用于实际。由于蜘蛛无法驯养和天然蜘蛛丝产量少等原因,惟有通过基因工程手段才能大量获取蜘蛛丝，满足蜘蛛丝潜在的应用需求。目前研究人员可以借助大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，哺乳动物细胞等表达系统进行蜘蛛丝蛋白的生物工程制备。其中，大肠杆菌表达系具有生长快、产量高、生产规模大、成本低、培养条件简单、遗传背景清楚等多重优点，目前被广泛应用于蜘蛛丝蛋白的重组表达研究中，但目前的工艺来说，相关蛛丝蛋白的表达水平仍然有限，无法有效的满足工业化制备的要求。申请人根据天然蜘蛛丝蛋白的性质设计了衍生自天然蜘蛛丝的蛋白序列，同时将编码重组蜘蛛丝蛋白序列的基因导入到大肠杆菌中进行蛋白表达，本申请旨在建立更高效的重组蜘蛛丝蛋白胞内可溶表达放大工艺。
技术实现思路
本申请设计了适用于蛋白大肠杆菌分泌表达放大的工艺路线，并对工艺中的关键质量参数进行优化，根据优化条件，完成产业化规模放大。本专利技术提供的蛋白分泌表达放大工艺，包括发酵以及纯化工艺，发酵工艺包括重组大肠杆菌活化、发酵种子液培养、高密度发酵，高密度发酵的诱导阶段温度为30℃-37℃，pH值为6.8-7.4，诱导剂添加量为0.5M-1M。作为优选，高密度发酵的诱导阶段温度为35℃-37℃，pH值为7.0-7.4，诱导剂添加量为0.5M。作为优选，高密度发酵菌体增殖初始阶段发酵温度为37℃，pH＝7.0±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％。作为优选，高密度发酵补料阶段补加甘油和七水合硫酸镁。作为优选，诱导阶段采用阿拉伯糖作为诱导剂进行诱导表达，并维持DO不低于40％。蛛丝分泌表达纯化工艺包括菌体破碎、过滤除菌体碎片、加热离心除杂蛋白、盐析收集蛋白、洗涤蛋白，作为优选，菌体破碎过程缓冲液为PBS缓冲液，加热20min除杂蛋白，盐析使用0.8-1.0M硫酸铵溶液，蛋白洗涤液使用50％-70％乙醇。作为优选，盐析使用0.9M硫酸铵溶液，蛋白洗涤液使用60％乙醇。本专利技术的放大工艺具有以下优点：采用的发酵培养基成分简单、成本低廉；发酵工艺中采用特定的控制条件，能耗更低，而表达量提高50％，纯度提高50％。附图说明图1：实施例1中发酵产物SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图1a为SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导2h后目的蛋白表达量，泳道2为诱导4h后目的蛋白表达量，泳道3为诱导6h后目的蛋白表达量。图1b为发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图2：实施例2中第一批次SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图2a为SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导2h后目的蛋白表达量，泳道2为诱导4h后目的蛋白表达量。图2b为发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图3：实施例2中第二批次SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图3a为第一批次SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导2h后目的蛋白表达量，泳道2为诱导4h后目的蛋白表达量。图3b为发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图4：实施例2中第三批次SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图4a为第二批次SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导2h后目的蛋白表达量，泳道2为诱导4h后目的蛋白表达量。图4b为发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图5：实施例3中中试发酵SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图5a为SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导2h后目的蛋白表达量，泳道2为诱导4h后目的蛋白表达量。图5b为发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图6：实施例3不同加热变性时间获得的目的蛋白SDS-PAGE电泳图。泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为破碎后上清加热10min目的蛋白表达量，泳道2为破碎后上清加热15min目的蛋白表达量，泳道3为破碎后上清加热20min目的蛋白表达量，泳道4为破碎后上清加热25min目的蛋白表达量。图7：实施例3不同盐析硫酸铵浓度获得的目的蛋白SDS-PAGE电泳图。泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为0.8M盐析后沉淀中目的蛋白，泳道2为0.8M盐析后上清中目的蛋白，泳道3为0.9M盐析后沉淀中目的蛋白，泳道4为0.9M盐析后上清中目的蛋白，泳道5为1M盐析后沉淀中目的蛋白，泳道6为1M盐析后上清中目的蛋白图8：实施例3不同乙醇浓度洗涤获得的目的蛋白SDS-PAGE电泳图。泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为阳性对照，泳道2为50％乙醇洗涤后洗涤液中目的蛋白，泳道3为60％乙醇洗涤后洗涤液中目的蛋白，泳道4为70％乙醇洗涤后洗涤液中目的蛋白。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术，应理解，引用实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1重组蛛丝蛋白小规模(3L)高密度发酵工艺步骤1：重组菌株活化取冻存于-80℃的重组蛛丝蛋白工作种子库中甘油菌种子(如中国专利CN201810093672.X、201810648563.X中所示，下述也相同)于LB固体培养基(酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂糖15g/L)划线，37℃恒温恒湿箱培养12h。步骤2：种子液培养挑取平板上单克隆菌落于LB液体培养基(酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L)，37℃，220rpm培养至OD600≈2，并在显微镜下观察无杂菌，即得到发酵用种子液。步骤3：发酵过程洗净赛多利斯BIOSTATB生物反应器，用pH＝7.0和pH＝4.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛛丝蛋白原核分泌表达放大工艺，包括发酵以及纯化工艺，发酵工艺包括重组大肠杆菌活化、发酵种子液培养、高密度发酵，其特征在于：高密度发酵菌体增殖初始阶段发酵温度为37℃，pH＝7.0±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％；高密度发酵的诱导阶段温度为35℃-37℃，pH值为7.0-7.4，诱导剂添加量为0.5M。/n

【技术特征摘要】
20181228 CN 20181162417011.蛛丝蛋白原核分泌表达放大工艺，包括发酵以及纯化工艺，发酵工艺包括重组大肠杆菌活化、发酵种子液培养、高密度发酵，其特征在于：高密度发酵菌体增殖初始阶段发酵温度为37℃，pH＝7.0±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％；高密度发酵的诱导阶段温度为35℃-37℃，pH值为7.0-7.4，诱导剂添加量为0.5M。


2.权利要求1所述蛛丝蛋白原核分泌表达放大工艺，其特征在于：高密度发酵补料阶段补加甘油和七水合硫酸镁。
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【专利技术属性】
技术研发人员：马永，张韬，赵百学，王安良，
申请(专利权)人：江苏京森生物医药新材料科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32