重组蛛丝蛋白的产业化生产方法技术

本发明专利技术涉及一种适用于蛛丝蛋白原核包涵体表达放大的生产工艺路线，对工艺中的关键质量参数进行优化，根据优化条件，完成产业化规模放大。本发明专利技术采用的发酵培养基成分简单、成本低廉；发酵工艺中采用特定的控制条件，能耗更低，表达量提高19％以上，纯度提高12％以上。

【技术实现步骤摘要】
重组蛛丝蛋白的产业化生产方法
本专利技术属于生物工程领域，涉及重组蛛丝蛋白的产业化生产方法。
技术介绍
蜘蛛丝既有钢般的坚硬,又有橡胶般的弹性。其突出的性能主要表现在:高强度、高弹性、高断裂功,可以说是迄今为止最强韧的材料,被誉为“生物钢”。随着对蜘蛛丝的研究深入,发现蜘蛛丝还具有生物可降解性、超收缩性、耐高温、耐低温及与生物组织的相容性等特性。由于蜘蛛丝这些独特的物理和生物学特性,它在医学、材料、军事和纺织等方面都有着广泛的应用前景。瑞典科学家JanJohansson利用无刺激性化学物质制造出的人工蜘蛛丝具有良好的生物相容性，可应用于脊髓修复或帮助干细胞生长来修复损伤的心脏组织等再生医学研究中，亦可用于自身防护用具等纺织工业应用中(NatureChemicalBiology,DOI:10.1038/nchembio.2269(2017))。鉴于蜘蛛丝蛋白巨大的潜在应用性,国内外学者加强对蜘蛛丝的研究,希望蜘蛛丝能够像蚕丝那样大规模地应用于实际。由于蜘蛛无法驯养和天然蜘蛛丝产量少等原因,惟有通过基因工程手段才能大量获取蜘蛛丝，满足蜘蛛丝潜在的应用需求。目前研究人员可以借助大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，哺乳动物细胞等表达系统进行蜘蛛丝蛋白的生物工程制备。其中，大肠杆菌表达系具有生长快、产量高、生产规模大、成本低、培养条件简单、遗传背景清楚等多重优点，目前被广泛应用于蜘蛛丝蛋白的重组表达研究中，但目前的工艺来说，相关蛛丝蛋白的表达水平仍然有限，无法有效的满足工业化制备的要求。申请人根据天然蜘蛛丝蛋白的性质设计了衍生自天然蜘蛛丝的蛋白序列，同时将编码重组蜘蛛丝蛋白序列的基因导入到大肠杆菌中进行蛋白表达，本申请旨在建立更高效的重组蜘蛛丝蛋白包涵体表达放大工艺。
技术实现思路
本申请设计了适用于蛛丝蛋白包涵体表达放大的工艺路线，并对工艺中的关键质量参数进行优化，根据优化条件，完成产业化规模放大。本专利技术提供的蛛丝蛋白原核包涵体表达放大工艺，包括发酵以及纯化工艺，发酵工艺包括重组大肠杆菌活化、发酵种子液培养、高密度发酵，、发酵菌体破碎、包涵体洗涤以及包涵体变性及盐析纯化。作为优选，高密度发酵的诱导阶段控制温度为33℃-35℃，pH值为7.0-7.4，DO25％-45％，通气量20L-100L，氧气比例50％-100％，诱导剂添加量0.1-0.5M。作为优选，高密度发酵的诱导阶段控制DO35％-45％，通气量20L，氧气比例100％，诱导剂添加量0.1M。蛛丝蛋白原核包涵体的纯化工艺包括菌体破碎、包涵体洗涤、变性液的盐析，作为优选，洗涤液为含3M的尿素，pH值6.0-7.0，盐析采用1.0M-2.0M硫酸盐。。作为优选，洗涤液还含1％曲拉通X-100，pH值6.0。本专利技术的放大工艺具有以下优点：采用的发酵培养基成分简单、成本低廉；发酵工艺中采用特定的控制条件，能耗更低，而表达量提高19％以上，纯度提高12％以上。附图说明图1实施例1中发酵产物SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图1-a为SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导后3h发酵包涵体变性液，泳道2为诱导后6h发酵包涵体变性液，泳道3为诱导后9h发酵包涵体变性液。图1-b为发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图2实施例2中工艺优化前发酵批次SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图2-a为SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导后2h发酵包涵体变性液，泳道2为诱导后4h发酵包涵体变性液，泳道3为诱导后6h发酵包涵体变性液，泳道4为诱导后8h发酵包涵体变性液。图2-b为发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图3实施例2中第一批次SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图3-a为第一批次SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导后2h发酵包涵体变性液，泳道2为诱导后4h发酵包涵体变性液，泳道3为诱导后6h发酵包涵体变性液。图3-b为发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图4实施例2中第二批次SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图4-a为第二批次SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导后2h发酵包涵体变性液，泳道2为诱导后4h发酵包涵体变性液，泳道3为诱导后6h发酵包涵体变性液。图4-b为发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图5实施例2中第三批次SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图5-a为第三批次SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导后2h发酵包涵体变性液，泳道2为诱导后4h发酵包涵体变性液，泳道3为诱导后6h发酵包涵体变性液。图5-b为发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图6实施例3中第一批次SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图6-a为第一批次SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导后2h发酵包涵体变性液，泳道2为诱导后4h发酵包涵体变性液，泳道3为诱导后6h发酵包涵体变性液。图6-b为发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图7实施例3中第二批次SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图7-a为第二批次SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导后2h发酵包涵体变性液，泳道2为诱导后4h发酵包涵体变性液，泳道3为诱导后6h发酵包涵体变性液。图7-b为发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图8实施例3中第三批次SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图8-a为第三批次SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导后2h发酵包涵体变性液，泳道2为诱导后4h发酵包涵体变性液，泳道3为诱导后6h发酵包涵体变性液。图8-b为发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图9实施例4不同洗涤工艺获得的目的蛋白SDS-PAGE电泳图。泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为洗涤配方一洗涤后包涵体变性液，泳道2为洗涤配方二洗涤后包涵体变性液，泳道3为洗涤配方三洗涤后包涵体变性液，泳道4为洗涤配方四洗涤后包涵体变性液，泳道5为洗涤配方五洗涤后包涵体变性液。图10实施例4变性液的SDS-PAGE电泳图。泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为发酵包涵体直接变性液，泳道2为发酵包涵体直接变性液离心上清液，泳道3为发酵包涵体直接变性液离心上清液盐析后蛋白变性液。图11实施例5变性液的SDS-PAGE电泳图。泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为发酵包涵体直接变性液，泳道2为发酵包涵体变性液离心上清液盐析后蛋白变性液。...

【技术保护点】
1.蛛丝蛋白原核包涵体表达放大工艺，包括发酵以及纯化工艺，发酵工艺包括重组大肠杆菌活化、发酵种子液培养、高密度发酵、发酵菌体破碎、包涵体洗涤以及包涵体变性及盐析纯化。/n

【技术特征摘要】
20181228 CN 20181162693361.蛛丝蛋白原核包涵体表达放大工艺，包括发酵以及纯化工艺，发酵工艺包括重组大肠杆菌活化、发酵种子液培养、高密度发酵、发酵菌体破碎、包涵体洗涤以及包涵体变性及盐析纯化。


2.权利要求1所述蛛丝蛋白原核包涵体表达放大工艺，其特征在于高密度发酵的诱导阶段控制温度为33℃-35℃，pH值为7.0-7.4，DO25％-45％，通气量20L-100L，氧气比例50％-100％，诱导剂添加量0.1-0.5M。


3.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，张韬，赵百学，王安良，
申请(专利权)人：江苏京森生物医药新材料科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32