重组人源化III型胶原蛋白止血海绵及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种重组人源化III型胶原止血海绵及其制备方法和应用。目前，业内一直期望实现大分子人源化胶原蛋白或者全人胶原蛋白的生产，一直都是一个难以完全突破的技术难点。本发明专利技术的重组人源化III型胶原蛋白分子量更接近于天然胶原蛋白；同时对其编码基因进行优化，实现了重组胶原蛋白的高效、分泌表达，产量较高。而以本发明专利技术胶原蛋白制备的止血海绵，相比于市售的同类产品或市售III型类人胶原，不管是体内还是体表都具有更优的止血、凝血效果，且在细胞毒性或溶血方面也具有更高的安全性，有利于产业化推广。因此，本发明专利技术的胶原蛋白止血海绵在临床上更利于外科、妇产科、整形科、口腔科等手术中创面止血的应用，使更多的患者从中受益。从中受益。

【技术实现步骤摘要】
重组人源化III型胶原蛋白止血海绵及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域及生物材料领域，具体涉及一种重组人源化III型胶原止血海绵及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是动物体中含量最丰富的一类蛋白质家族，其生物活性使其能参与细胞迁移、分化和繁殖，使结缔组织具有机械强度，此外还能促进细胞生长，具有止血、生物相容性、生物降解性等性质。基于这些特性，胶原蛋白在烧伤、创伤、眼角膜疾病、创伤面止血、药物传递、缓释技术等医药领域均有广泛应用。
[0003]至今已发现30余种胶原蛋白链的编码基因，可以形成16种以上胶原蛋白分子，常见类型为I、II、III、V和XI型。其中I型胶原蛋白是动物体内含量最多的，占全部胶原蛋白含量的80
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90％，其对机体功能作用最强，因此在临床上I型胶原蛋白的应用最广。I型胶原蛋白主要存在于成人皮肤、肌腱及骨组织上，III型胶原蛋白主要存在于婴儿的皮肤或血管内膜、肠道上及成人软骨、玻璃体、椎间盘上等。其中，III型胶原蛋白(CLO3A1)的合成能力很强，能够在创伤修复中将来源于骨髓的干细胞分化成帮助修复的纤维细胞。因此，在生物医药工程中，III型胶原蛋白在修复组织创伤、支撑细胞再组、改善皮肤状态、提升皮肤弹性与柔嫩度等方面应用更为广泛。
[0004]传统的胶原蛋白生产工艺主要是通过酸碱水解法从动物组织中提取，但该工艺获得的产品成分复杂，纯度较差，而且在提取过程中极易丧失部分生物活性，临床表现出排斥反应，存在极大的病毒隐患。此外，由于动物组织中III型胶原蛋白含量较少，也限制了其天然提取的可能性。
[0005]近年来，随着DNA重组技术的发展，为了能充分利用胶原蛋白的优良特性，研究者们选用各种宿主细胞(如大肠杆菌、酵母、昆虫、哺乳动物等)，希望生产出安全性好、重现性高、质量稳定的重组人胶原蛋白。大肠杆菌表达系统虽然具有表达量高的特点，但是其存在产生热源、包涵体表达难以纯化、原核系统无翻译后修饰、产物生物活性低等不足；而哺乳动物细胞和昆虫细胞等表达系统虽然具有翻译后修饰功能，但生产周期长、培养难度大、成本高表达量低的缺点限制了应用。毕赤酵母表达系统作为微生物系统兼顾了产物表达量高、容易纯化和具有翻译后修饰的功能，在表达胶原蛋白中具有非常突出的优势。而胶原蛋白亚基的分子量一般都在120kDa左右，远大于一般的生物活性蛋白，且其氨基酸序列中含有大量Gly
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X
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Y(X、Y代表氨基酸，其中Y多为脯氨酸)重复，因此对于依靠基因工程技术通过生物发酵法获取的重组胶原蛋白或者类似物来说，在表达产物长度与表达水平上都有很大的难度。
[0006]因此，目前已有的重组人(类人)III胶原蛋白的公开报道中，主要都是以天然人III型胶原蛋白的部分片段或者部分人III型胶原蛋白片段拼接其他类型人胶原蛋白片段进行重组表达。例如中国专利CN111363029A中公开了一种通过毕赤酵母表达重组人III型胶原蛋白成熟肽的方法，其中所表达的胶原蛋白仅是498个氨基酸。再如中国专利
CN103122027B公开的一种重组人源胶原蛋白，其中所表达的蛋白即为人胶原蛋白III型肽段及人胶原蛋白II型肽段所构成的257～501个氨基酸的拼接肽段。再如中国专利CN103725623A中公开了一种分泌表达人III型胶原α链蛋白的毕赤酵母工程菌及其构建方法与应用，其中虽然宣称可以分泌表达有1069个氨基酸的人III胶原蛋白成熟肽，但是并未提供详细的表达方面的证据，并且，众所周知常用的大肠杆菌和酵母表达体系中不含脯氨酸羟化酶，因此在不引入外部的例如脯氨酸羟化酶(如P4H)共表达的情况下，由酵母直接表达的胶原蛋白，其中是不可能有羟脯氨酸的，因此，该专利中通过羟脯氨酸含量来计算胶原蛋白表达量也是不可能实现，并且其表达量也仅有1g/L，对于产业化生产仍然较低。而另一方面，分子量大的人源化胶原蛋白相比较于小分子人源化胶原蛋白或者类人胶原蛋白主要有以下优点：(1)小分子人源化胶原或者类人胶原分子量小，所能提供的交联反应的位点基团比较少，因此在同样交联条件下，大分子人源化胶原更容易被交联固定。所制备的生物材料，具有更长的降解时间上限(该时间可以通过交联工艺调节)。尤其对于体内修复的生物材料应用场景时，较长的降解时间才有可能伴随伤口的修复而发挥作用，而小分子胶原生物材料很可能在创伤未完成修复的时候就完全降解吸收，导致材料崩解与伤口修复无法同步。(2)小分子人源化胶原或者人为设计的类人胶原从分子量上来讲更像是大分子胶原蛋白的降解产物明胶，由于较大程度上丧失了分子的完整性，因此在生物体内，依赖于大分子胶原发挥的胶原活性性质就减弱或者很大程度丧失。因此，更大的分子量和更接近天然胶原的结构具有更大的优势。
[0007]目前，业内一直期望实现大分子人源化胶原蛋白或者全人胶原蛋白的生产，但是受限于现有的重组表达技术，一直都是一个难以完全突破的技术难点。
[0008]本专利技术的重组人源化III胶原蛋白是以人III型胶原蛋白α1(COL3A1)链氨基酸序列为基础对氨基酸序列进行有效筛选，不仅保留胶原蛋白的核心功能序列，而且分子量更接近于天然胶原蛋白；同时对其编码基因进行优化，以实现重组胶原蛋白的高效、分泌表达，提高产量。

技术实现思路

[0009]本专利技术目的在于提供一种利用毕赤酵母进行表达的重组人源化胶原蛋白，其分子量接近于人的天然蛋白，不仅表达量高，也具有优良的生物功能。
[0010]本专利技术的目的之一是提供一种重组人源化III型胶原蛋白，其通过毕赤酵母分泌表达，且氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]优选的所述重组人源化III型胶原蛋白，其编码基因如SEQ ID NO.5所示。
[0012]本专利技术的另一目的是提供一种重组人源化III型胶原蛋白的制备方法，其包含以下步骤
[0013](1)将上述基因序列克隆至表达载体中，转化毕赤酵母工程菌，筛选获得能够高效表达重组人源化胶原蛋白的工程菌；
[0014](2)对基因工程菌进行发酵培养，诱导表达重组人源化胶原蛋白，获得含目标蛋白的发酵液；
[0015](3)对发酵液进行纯化，获得重组人源化III型胶原蛋白。
[0016]优选的，所述表达载体为pGAPZαA，所述毕赤酵母工程菌为毕赤酵母GS115。
[0017]本专利技术的另一目的是提供一种重组人源化III型胶原蛋白在制备止血海绵、骨修复材料、医疗或医美用填充材料、化妆品中的应用。
[0018]本专利技术的另一目的是提供一种重组人源化III型胶原止血海绵，所述重组人源化III型胶原止血海绵，含有上述重组人源化III型胶原蛋白。
[0019]优选的，所述重组人源化III型胶原止血海绵，按以下方法制备：
[0020](1)在酸性溶液中添加重组III型人源化胶原蛋白，制得胶原蛋白溶液；
[0021](2)将胶原蛋白溶液进行冷冻干燥，再进行交联，即得。
[0022]优选的，所述酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人源化III型胶原蛋白止血海绵，其特征在于，其含有重组人源化III型胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.如权利要求1所述的止血海绵，其中所述重组人源化III型胶原蛋白，其编码基因如SEQ ID NO.5所示。3.如权利要求1所述的止血海绵，其中所述重组人源化III型胶原蛋白由以下方法制备：(1)将如权利要求3所述的基因序列克隆至中表达载体，转化毕赤酵母工程菌，筛选获得能够高效表达重组人源化胶原蛋白的工程菌；(2)对基因工程菌进行发酵培养，诱导表达重组人源化胶原蛋白，获得含目标蛋白的发酵液；(3)对发酵液进行纯化，获得重组人源化胶原蛋白。4.如权利要求3所述的制备方法，其中所述表达载体为pGAPZαA、所述毕赤酵母工程菌为毕赤酵母GS115。5.一种止血海绵的制备方法，包含以下步骤：(1)在酸性溶液中...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，袁佳昀，赵百学，陆静波，杨丽嫔，江辰阳，
申请(专利权)人：江苏京森生物医药新材料科技有限公司，
类型：发明
国别省市：