用于OCA2基因突变的CRISPR系统及其在构建白化病克隆猪核供体细胞中的应用技术方案

本发明专利技术公开了用于OCA2基因突变的CRISPR系统及其在构建白化病克隆猪核供体细胞中的应用。一种用于OCA2基因编辑的gRNA，序列如SEQ ID NO：39所示。一种针对猪OCA2基因的gRNA表达载体，以全序列如SEQ ID NO.3所示的pKG

【技术实现步骤摘要】
用于OCA2基因突变的CRISPR系统及其在构建白化病克隆猪核供体细胞中的应用


[0001]本专利技术属于基因编辑
，具体涉及用于OCA2基因突变的CRISPR/Cas9系统及其在构建白化病克隆猪核供体细胞中的应用。

技术介绍

[0002]白化病(albinism)是由于黑色素合成减少或缺乏而导致的多种遗传性疾病的总称，主要表现为皮肤、毛发以及眼部的色素减退。多种基因的突变均可以导致白化病的症状。根据色素缺失的部位以及有无其他系统异常，可将白化病分为非综合征性白化病和综合征性白化病两大类。非综合征白化病又可再分为只有眼部色素缺乏的眼白化病(OA)和皮肤、毛发、眼睛均有色素缺失(即具有全身症状)的眼及皮肤白化病(OCA)。
[0003]眼及皮肤白化病(oculocutaneous albinism，OCA)是一组以眼、皮肤、毛发黑色素沉着减少或缺乏为主要临床表现的常染色体隐性遗传病。超过90％的白化病患者为OCA，一般是由黑色素合成或转运相关基因突变所引起的，主要临床表现为普遍色素沉着不足，眼部改变包括黄斑中心凹发育不良、屈光不正、视力低下、畏光、虹膜半透明、眼球震颤、眼底着色不足及视觉纤维通路异常等。OCAII型约占OCA的30
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50％，是OCA2基因突变致使其编码的OCA2蛋白功能丧失引起的。已有研究结果表明，OCA2蛋白对于黑素小体的正常生物发生很重要，可能参与黑色素细胞内酪氨酸(黑色素合成的前体)的运输、调节黑素体的pH值和黑素体的成熟度、调节酪氨酸酶的翻译后加工(黑色素合成中的限速反应)等黑素小体蛋白正常加工和转运的过程。因此，基于OCA2基因突变构建眼及皮肤白化病动物模型将为研究及治疗人类相关疾病提供有力的实验工具。
[0004]基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因敲入到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于OCA2基因编辑的靶点gRNA及其表达载体。
[0006]本专利技术的另一目的是提供一种用于猪OCA2基因编辑的CRISPR/Cas9系统。
[0007]本专利技术的又一目的是提供所述的gRNA表达载体、所述的CRISPR/Cas9系统在构建眼及皮肤白化病克隆猪核供体细胞中的应用。
[0008]一种用于OCA2基因编辑的靶点gRNA，序列如SEQ ID NO.21所示。
[0009]一种用于OCA2基因编辑的gRNA，序列如SEQ ID NO.39所示。
[0010]一种针对猪OCA2基因的gRNA表达载体，以全序列如SEQ ID NO.3所示的pKG
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U6gRNA为载体骨架，表达权利要求2所述的gRNA。
[0011]作为本专利技术的一种优选，所述的表达载体是将SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的单链DNA退火得到的具有粘性末端的双链DNA分子插入载体骨架pKG
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U6gRNA的BbsI限制性内切酶位点所得。
[0012]一种用于猪OCA2基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体和权利要求3或4所述的针对猪OCA2基因的gRNA表达载体。
[0013]作为本专利技术的一种优选，所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pU6gRNA
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eEF1a
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mNLS
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hSpCas9
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EGFP
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PURO载体。
[0014]作为本专利技术的进一步优选，所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为1～3:1，进一步优选3:1。
[0015]本专利技术所述的gRNA表达载体、所述的CRISPR/Cas9系统在构建眼及皮肤白化病克隆猪核供体细胞中的应用。
[0016]一种重组猪成纤维细胞，由所述的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。
[0017]本专利技术所述的重组细胞在构建OCA2基因敲除的克隆猪中的应用；优选在构建OCA2基因敲除的眼及皮肤白化病克隆猪中的应用。
[0018]与现有技术相比，本专利技术至少具有如下有益效果：
[0019](1)本专利技术研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。
[0020]大小鼠等啮齿类动物不论从生理、病理及体型上，均与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。灵长类动物扩繁速度慢、数量少、成本高，动物保护及伦理等方面的要求也较高。而猪就没有上述缺点，同时猪的克隆技术非常成熟，饲养及克隆成本较灵长类低得多。因此猪是非常适合作为人类疾病模型的动物。
[0021](2)本专利技术中经过实验验证改造的pU6gRNA
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eEF1a
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mNLS
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hSpCas9
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EGFP
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PURO载体相对改造前的pX330载体，更换了更强的启动子及添加了增强蛋白翻译的元件，提高了Cas9的表达，并且增加了核定位信号个数，提高了Cas9蛋白的核定位能力，具有更高的基因编辑效率。本专利技术还在载体中加入了荧光标记及抗性标记，使其更方便运用于载体阳性转化细胞的筛选及富集。采用本专利技术筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率较之原载体有极显著提高。
[0022](3)本专利技术针对OCA2基因的不同靶点gRNA设计了相应的表达载体，通过筛选获得具有较高编辑效率的gRNA及其表达载体。配合本专利技术改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑，通过靶标基因PCR产物测序结果可分析出所获单细胞克隆的基因型(双等位基因相同变异的纯合突变型、双等位基因不同变异的纯合突变型、杂合突变型或野生型)，获得纯合突变的概率为30％～50％，优于使用胚胎注射技术的模型制备方法(即受精卵注射基因编辑材料)中获得纯合突变的概率(低于5％)。
[0023](4)利用本专利技术所得到的纯合突变单细胞克隆株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶标基因纯合突变的克隆猪，并且该纯合突变可稳定遗传。
[0024]本专利技术采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑并筛选阳性编辑单细胞克隆的方法，后期再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应疾病模型猪，可大大缩短
模型猪制作周期并节省人力、物力、财力。
附图说明
[0025]图1为质粒pX330的结构示意图。
[0026]图2为质粒pU6gRNACas9的结构示意图。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于OCA2基因编辑的gRNA靶点，其特征在于序列如SEQ ID NO.21所示。2.一种用于OCA2基因编辑的gRNA，其特征在于序列如SEQ ID NO.39所示。3.一种针对猪OCA2基因的gRNA表达载体，其特征在于以全序列如SEQ ID NO.3所示的pKG
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U6gRNA为载体骨架，表达权利要求2所述的gRNA。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于将SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的单链DNA退火得到的具有粘性末端的双链DNA分子插入载体骨架pKG
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U6gRNA的BbsI限制性内切酶位点所得。5.一种用于猪OCA2基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于包含Cas9表达载体和权利要求3或4所述的针对猪OCA2基因的gRNA表达载体。6.根据权利要求5所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于所述的C...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，汪滔，陶裴裴，曾为俊，刘璐，王磊，程锐，马翔，赵泽英，黄彩云，
申请(专利权)人：南京启真基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：