靶向SMN2启动子区甲基化位点nt-290所在区域的反义寡核苷酸制造技术

本发明专利技术提出靶向SMN2启动子区甲基化位点nt

【技术实现步骤摘要】
靶向SMN2启动子区甲基化位点nt
‑
290所在区域的反义寡核苷酸


[0001]本专利技术涉及反义寡核苷酸
，特别是涉及靶向SMN2启动子区甲基化位点nt
‑
290所在区域的反义寡核苷酸。

技术介绍

[0002]脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传性神经肌肉病，由脊髓前角及延髓运动神经元变性导致，以近端肢体和躯干进行性、对称性肌无力和肌萎缩为特点，随病情进展常累及多系统。该病的发病率在存活新生儿中约为1/6000～1/10000，位居婴儿致死性遗传病的首位，其中呼吸衰竭是最常见的死亡原因。SMA的临床表现差异较大，根据患者的发病年龄和获得的最大运动功能分为5型。位于染色体5q11.2
‑
q13.3区域的运动神经元存活基因1(survival motor neuron 1，SMN1)的纯合缺失或者复合杂合突变均使得SMN蛋白表达水平下降而导致SMA的发生。SMN1基因存在与其高度同源的SMN2基因，SMN2在外显子7的一个碱基差异(c.840C>T)导致了前体mRNA的选择性剪接的改变，使大多数SMN2转录产物跳跃了外显子7，产生截断的不稳定的SMN蛋白质(称为SMNΔ7)，但仍有10％的SMN2基因表达全长转录本，产生少量的有功能的SMN蛋白。因此SMN2是SMA的表型修饰基因，其拷贝数的多少与疾病的严重程度呈负相关，修正SMN2的剪接或提升SMN2表达水平是目前SMA的治疗策略。反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)是人工合成的单链核酸链，长度在8～50个核苷酸之间，通过标准Watson
‑
Crick碱基配对原则与靶基因mRNA 结合，从而干扰靶基因的表达。反义寡核苷酸药物具有特异性高、药效高、毒副作用低等特点，随着化学修饰的改进，其与靶基因的杂交亲和力增强，也获得了更高的稳定性。近年来ASO技术的进步，通过脊髓腔注射可以使ASO在神经系统中广泛分布，并且在治疗神经退行性疾病(肌萎缩侧索硬化症、SMA、杜氏肌营养不良症等)中取得突破性进展。寻找新的有效的反义寡核苷酸靶标，对于开发新的SMA治疗方案非常有益。
[0003]近年来SMA治疗进展很快。治疗策略主要以提升全长SMN蛋白水平的SMN靶向性治疗为主，包括：(1)基因替代治疗：腺相关病毒AAV9导入外源性的SMN1 cDNA序列，如2019年在美国上市的AVXS
‑
101；(2)纠正SMN2错误剪接：2016年在美国经FDA批准上市的Nusinersen(诺西那生钠，Biogen公司)，靶向屏蔽SMN2内含子7的关键剪接开关区ISS
‑
N1调控SMN2选择性剪接的一种反义寡核苷酸，于2019年2月进入中国，2019年10月应用于SMA病人治疗；2020年在美国上市的罗氏公司的靶向SMN2基因外显子7的剪接负性调控区5
’
末端的小分子化合物药物(Evrysid/Risdiplam)；(3)增加SMN2转录水平：如组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)。然而，这些药物存在以下缺点：(1)AVXS
‑
101：天价治疗药物(约合人民币1400万)，系病毒载体导入外源基因病毒载量对肝肾的损伤等副反应，存在价格昂贵和药物长期安全性不明的局限性。(2)Nusinersen和Evrysid/Risdiplam：均为国外进口药物，存在治疗价格十分昂贵(100万/年)、应答率50％左右、长期疗效及安全性不明等局限性。而且两种药物只是在较低的SMN2基因整体转录水平上去调控SMN2选择性剪接来提升全长转录版
本的表达水平，进而增加SMN蛋白表达的水平，并不能增加SMN2基因的转录水平的总量。(3)组蛋白去乙酰化酶抑制剂：HDACi可以促进SMN2基因启动子区的高乙酰化，增强转录，提升SMN水平，但是HDACi的作用是广谱的，对众多基因的启动子区均产生效应，并不特异性靶向SMN2基因的启动子区，最终在临床实验中并没有取得理想的治疗效果。
[0004]我们前期研究发现：SMN2基因的表达还受到其启动子区的甲基化水平的表观调控作用。SMN2基因转录活性与启动子区甲基化水平呈负相关、并发现与SMN2表达相关的关键甲基化位点，其中nt
‑
290位点的甲基化水平与疾病严重程度存在显著负相关。本次研究也沿用了反义寡核苷酸可以通过特异性与靶基因结合干扰靶基因的表达特点，针对前期研究的结果明确的SMN2启动子区的关键甲基化位点/区(nt
‑
290)设计了靶向性结合的ASO(ASO
‑
AP1)。

技术实现思路

[0005]鉴于此，本专利技术提供了靶向SMN2启动子区甲基化位点nt
‑
290所在区域的反义寡核苷酸，具体技术方案如下：
[0006]靶向SMN2启动子区甲基化位点nt
‑
290所在区域的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸能够结合至SMN2基因启动子区，所述反义寡核苷酸的结合发生在SMN2基因启动子区的关键甲基化区域内；
[0007]所述关键甲基化区域为SMN2基因启动子区的
‑
300～
‑
276之间的区域内；
[0008]所述反义寡核苷酸能够与SMN2基因启动子区上
‑
300～
‑
276之间的区域序列杂交；
[0009]所述反义寡核苷酸的序列为5
’‑
GAGUGCAGCGGCGCGAUCUCGGCUC
‑3’
；
[0010]所述反义寡核苷酸均经过2
’‑
甲氧乙基修饰和硫代修饰来提高稳定性。
[0011]一种药物组合物，所述药物组合物包含所述反义寡核苷酸与可药用载体，所述可药用载体将所述反义寡核苷酸转运到靶细胞中，所述药物组合物被装载细胞中。
[0012]进一步的，所述可药用载体包括糖、聚胺、氨基酸、肽、脂质中的至少一种。
[0013]一种用于促进细胞中SMN2基因表达的方法，包括使所述细胞与有效量的能够结合至SMN2启动子区的反义寡核苷酸接触，其中所述反义寡核苷酸的结合发生在所述启动子区上的
‑
300～
‑
276之间的区域内，所述反义寡核苷酸包含上述定义的特征；
[0014]进一步的，所述细胞为脊髓性肌萎缩症患者的皮肤成纤维细胞。
[0015]一种用于治疗脊髓性肌萎缩症的方法，要求调节对其有需要的个体的SMN2基因的表达，所述方法包括使所述个体的细胞与有效量的能够结合至SMN2启动子区的反义寡核苷酸接触，其中所述反义寡核苷酸的结合发生在所述启动子区上的
‑
300～
‑
276之间的区域内。
[0016]进一步的，所述反义寡核苷酸包含上述定义的特征。
[0017]采用上述技本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.靶向SMN2启动子区甲基化位点nt
‑
290所在区域的反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸能够结合至SMN2基因启动子区，所述反义寡核苷酸的结合发生在SMN2基因启动子区的关键甲基化区域内；所述关键甲基化区域为SMN2基因启动子区的
‑
300～
‑
276之间的区域内；所述反义寡核苷酸能够与SMN2基因启动子区
‑
300～
‑
276之间的区域序列杂交；所述反义寡核苷酸的序列为5
’‑
GAGUGCAGCGGCGCGAUCUCGGCUC
‑3’
；所述反义寡核苷酸均经过2
’‑
甲氧乙基修饰和硫代修饰来提高稳定性。2.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含所述反义寡核苷酸与可药用载体，所述可药用载体将所述反义寡核苷酸转运到靶细胞中，所述药物组合物被装载细胞中。3.根据权利要求2所述的一种药物组合物，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：瞿宇晋，宋昉，王嘉，白晋丽，
申请(专利权)人：首都儿科研究所，
类型：发明
国别省市：