一种适用于酵母多基因敲除的CRISPR/Cas9系统及其构建方法和应用技术方案

本发明专利技术公开了一种适用于酵母多基因敲除的CRISPR/Cas9系统及其构建方法和应用。本发明专利技术构建了适用于酿酒酵母多基因敲除的CRISPR/Cas9载体，并对其中的毒素抗性基因pdr5、pdr10和pdr15进行敲除，并通过抗毒实验验证毒素敏感型酿酒酵母的抗毒效果。本发明专利技术提供了酵母甚至其他真菌的多基因敲除CRISPR/Cas9系统敲除方法，并为其他毒素抗性基因的抗毒效果的验证提供了可靠的模式菌株。本发明专利技术通过在同源修复模板中提前引入终止子实现基因的失活，因此本发明专利技术提供的多基因敲除方法具有载体构建简单、敲除效率高、成本低等优势。因此可以广泛应用于酵母及丝状真菌的多基因敲除，从而促进酵母及丝状真菌的基因工程改造。及丝状真菌的基因工程改造。及丝状真菌的基因工程改造。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于酵母多基因敲除的CRISPR/Cas9系统及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种适用于酵母多基因敲除的CRISPR/Cas9系统及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]酿酒酵母是一种运用非常广泛的单细胞真核细胞工厂，具有易培养、遗传背景清晰和基因操作便捷高效等优点。酿酒酵母是第一个被完整测序的真核生物，拥有蛋白表达的翻译后修饰的能力，且不含内毒素，这些优点使得酿酒酵母被广泛地应用于工业化生产重组蛋白。由于遗传背景接近，酿酒酵母常常被用作合成真核生物来源的次级天然产物，或鉴定单一的功能蛋白。利用酿酒酵母生产青蒿素(Artemisinin)前体Artemisinic acid是这一领域最著名的应用。
[0003]酿酒酵母作为适应力较强的真核微生物，具有一套系统而完整的自我保护机制。微生物的自我保护机制包括将细胞内有毒物质转运出去和将其转化或分解成低毒性化合物。前人研究发现酿酒酵母中存在pdr5、pdr10和pdr15等编码抗毒蛋白的基因。基因pdr5编码了一个属于ABC转运子蛋白(PDR5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于酵母多基因敲除的CRISPR/Cas9系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)利用CRISPR网站分别分析和选取多个目的基因的基因敲除靶点；2)根据选定的敲除靶点，利用同源重组技术，将靶点序列导入到CRISPR
‑
Cas9敲除载体p426
‑
PSNR52
‑
gRNA.CAN1.Y
‑
TSUP4中，分别构建出多个单敲载体；3)在构建好的单敲质粒的基础上，利用同源重组技术构建同时敲除多个基因的多敲载体；4)根据选定的敲除靶点设计供基因组修复的同源重组片段Donor DNA，将终止密码子TAA引入到PAM序列NGG上或附近；由此得到适用于酵母多基因敲除的CRISPR/Cas9系统。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，具体为：1)利用CRISPR网站分别分析和选取了三个目的基因pdr5、pdr10、pdr15的基因敲除靶点；2)根据选定的敲除靶点，利用同源重组技术，将靶点序列导入到CRISPR
‑
Cas9敲除载体p426
‑
PSNR52
‑
gRNA.CAN1.Y
‑
TSUP4中，分别构建出三个单敲载体p426
‑
Δpdr5、p426
‑
Δpdr10和p426
‑
Δpdr15；3)在构建好的单敲质粒的基础上，利用同源重组技术构建同时敲除三个基因的三敲载体p426
‑
Δpdr5
‑
10
‑
15；4)根据选定的敲除靶点设计供基因组修复的同源重组片段Donor DNA，将终止密码子TAA引入到PAM序列NGG上或附近；由此得到适用于酵母三基因敲除的CRISPR/Cas9系统。3.一种利用权利要求1或2所述的适用于酵母多基因敲除的CRISPR/Cas9系统敲除基因的方法，其特征在于，是将多敲载体和Donor DNA转...

【专利技术属性】
技术研发人员：章卫民，叶伟，朱牧孜，李赛妮，岑由飞，李浩华，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：