一种肌钙蛋白IE13单链抗体的制备方法技术

本发明专利技术首先以E13杂交瘤细胞株为原料提取总mRNA，以此为模板反转录得到cDNA，选用IgG保守区序列特异性引物扩增单抗的轻链可变区和重链可变区基因，将扩增得到的轻、重链可变区基因序列在IMGT数据库进行生物信息学分析，得到序列准确可靠的候选轻链和重链可变区基因，通过本发明专利技术的制备方法获得cTnI E13单克隆细胞株的轻重链可变区基因序列，实现以基因序列形式对E13单抗细胞株实现永久保种；并提供一种原核表达E13单链抗体的制备方法，为后续建立过程简易，成本低廉的诊断抗体原料制备工艺提供基础。提供基础。提供基础。

【技术实现步骤摘要】
一种肌钙蛋白I E13单链抗体的制备方法


[0001]本专利技术涉及肌钙蛋白I E13单链抗体的制备，具体是从E13单克隆细胞株中克隆出轻重链可变区基因，并构建单链抗体重组表达工程菌，得到能用于配制肌钙蛋白I测定试剂(免疫法)的单链抗体原料。

技术介绍

[0002]据世界卫生组织统计，目前冠心病是世界十大死因中排行第一的疾病，全球每年约有1700万人死于冠心病，被称为“人类健康的第一杀手”。急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是造成冠心病人死亡的主要原因。AMI典型病例可以根据病史、症状及心电图的特殊改变进行诊断，但大量的临床实践发现，约有25％的AMI病人发病早期并无典型的临床症状，约50％的AMI病人缺乏心电图的特异改变，在此情况下，检测血液中的心肌损伤标志物具有重要价值。目前，肌钙蛋白I(cTnI)因在稳定性、特异性及灵敏度等方面的综合优势，已获得美国心脏协会(AHA)，美国心脏病学会(ACC)和欧洲心脏病学会(ESC)等众多权威组织的认可，逐渐成为AMI诊断的“金标准”。
[0003]临床应用的cTnI免疫检测试剂盒主要包括免疫反应体系(抗体特异性识别抗原)和信号输出体系(反应信号放大和读取方式)，其中免疫反应体系中所需的抗体质量对免疫检测系统性能起决定性作用，目前常用的cTnI抗体大多是通过杂交瘤技术制备的全长单抗，但因全长单抗制备的生产工艺流程复杂、开发周期长、投入成本高等原因，致使抗体原料成为免疫检测试剂生产成本降低的一大制约因素。另外，分泌全长单抗的杂交瘤细胞株使用几代后逐渐退化，产量降低，甚至有染色体丢失失去抗体分泌能力的风险。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对现有技术的上述不足，提供一种肌钙蛋白I E13单链抗体的制备方法。
[0005]本专利技术的目的是通过基因克隆技术获得cTnI E13单克隆细胞株的轻重链可变区基因序列，从而实现以基因序列形式对E13单抗细胞株实现永久保种；另一目的是提供一种原核表达E13单链(scFv)抗体的制备方法。
[0006]本专利技术的目的将通过以下技术方案实现：
[0007]1).E13单克隆细胞株总RNA提取
[0008]取适量分泌cTnI E13单抗的杂交瘤细胞株，采用Trizol试剂法提取总RNA，再依次经氯仿萃取和乙醇洗涤后获得总RNA。通过测定RNA的OD
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/OD
280
值确定RNA浓度和受蛋白污染情况；通过琼脂糖电泳观测28S/18S条带情况，确定提取的RNA完整性和DNA污染情况。具体步骤如下：
[0009]1.1)取适量杂交瘤细胞按一定比例加入Trizol试剂后，室温放置一定时间，使其充分裂解。12000g离心5min，弃沉淀；
[0010]1.2)按与加入Trizol体积的一定比例加入氯仿，振荡混匀后室温放置一定时间。4℃12000g离心15min；
[0011]1.3)吸取上层水相，至另一离心管中。按加入Trizol体积的一定比例加入异丙醇混匀，室温放置一定时间；4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；
[0012]1.4)按加入Trizol体积的一定比例加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；4℃8000g离心5min，尽量弃上清；
[0013]1.5)室温晾干或真空干燥5min。用50μl H2O溶解RNA样品，60℃水浴孵育10min(注：H2O须用DEPC处理并高压灭菌)；
[0014]1.6)测OD值定量RNA浓度，提取RNA的A
260
/A
280
值在1.6-1.8之间；
[0015]1.7)琼脂糖电泳鉴定RNA，确定制备RNA完整性和DNA污染情况。
[0016]上述1.1)中加入Trizol试剂比例为0.1～1.0ml/106个杂交瘤细胞；
[0017]上述1.1)中室温放置时间为1.0～10min；
[0018]上述1.2)中加入氯仿试剂比例为20～1000μl/ml Trizol；
[0019]上述1.2)中室温放置时间为1.0～20min；
[0020]上述1.3)中加入异丙醇试剂比例为0.1～1.0ml/ml Trizol；
[0021]上述1.3)中室温放置时间为1.0～10min；
[0022]上述1.4)中加入异丙醇试剂比例为0.1～2.0ml/ml Trizol；
[0023]2).E13单抗基因克隆
[0024]采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术进行单抗基因的克隆扩增，RACE技术是一种基于PCR技术的快速扩增cDNA5
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和3
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末端的有效方法。因仅需克隆单抗的可变区序列，故只进行5
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RACE实验即可。采用商品化的RACE 5
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试剂盒(Clonetech公司)进行试验，具体试验步骤如下：
[0025]2.1)CDNA合成
[0026]2.1.1)取4.0μl 5
×
First-Strand buffer，0.5μl 100mM DTT，1.0μl 20mM dNTPs在离心管中轻混，室温下放置至第2.1.4)步完成；
[0027]2.1.2)取1.0μl提取的总RNA，1.0μl 5
’-
CDS Primer A，9μl纯水在另一离心管中混合；
[0028]2.1.3)72℃孵育3min后冷却至42℃再孵育2min，冷却后，14000g离心10sec，收集管底成分；
[0029]2.1.4)每个反应体系中加入1μl SMARTer II A寡核苷酸；
[0030]2.1.5)取5.5μl 2.1.1)混合液，0.5μl RNase抑制剂(40Μ/μl)，2.0μl SMART Scribe Reverse Transcriptase(100Μ)混合；
[0031]2.1.6)将2.1.4)，2.1.5)两组成分混合，移液器轻轻吹混，轻微离心；42℃90min后，70℃下孵育10min；
[0032]2.1.7)加90μl Tricine-EDTA buffer稀释以上cDNA反应体系；
[0033]以上即获得用于5
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RACE的cDNA；
[0034]2.2)RACE试验
[0035]2.2.1)将15.5μl PCR-Grade H2O，25.0μl 2
×
SeqAmp Buffer，1.0μl SeqAmp DNAPolymerase混合；
[0036]2.2.2)将41.5μl上步预混液，2.5μl cDNA，5μl 10
×
ΜPM引物，1μl GSP引物(目的基因特定引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种肌钙蛋白I E13单链抗体，其特征在于，其基因序列如SEQ ID No:5所示。2. 根据权利要求1所述的肌钙蛋白I E13单链抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。3. 一种肌钙蛋白I E13单链抗体的制备方法，其特征在于，制备步骤包括：（1）E13单克隆细胞株总RNA提取：取适量分泌cTnI E13单抗的杂交瘤细胞株，采用Trizol试剂法提取总RNA，再依次经氯仿萃取和乙醇洗涤后获得总RNA；通过测定RNA的OD
260
/OD
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值确定RNA浓度和受蛋白污染情况；通过琼脂糖电泳观测28S/18S条带情况，确定提取的RNA完整性和DNA污染情况；（2）E13单抗基因克隆：采用cDNA 末端快速扩增技术进行单抗基因的克隆扩增，采用商品化的SMARTer
® RACE 5
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试剂盒进行试验；（3）轻重链可变区测序结果分析：采用IMGT数据库以及NCBI数据库中的IgBLAST功能分别对轻、重链可变区基因的Sanger测序结果进行分析，包括对胚系基因同源性、开放阅读框的合理性、可变区的互补决定区（CDR）和骨架区（FR）序列长度以及信号肽序列完整性等生物信息进行分析，并排除来源宿主细胞的抗体基因和假基因，最终选择完整准确的可变区基因序列进行下一步的scFv基因构建；（4） scFv基因修饰及合成：scFv是由抗体重链可变区VH和轻链可变区VL通过几十个氨基酸的短肽连接而成，将通过基因克隆获得的E13单抗VH和VL序列用短肽连接，在其-NH2端添加原核分泌信号肽，在-COOH端添加定点标记和纯化短肽标签，可供后续scFv单链抗体进行生物素化或信号物质标记的定点修饰，以及进行金属螯合亲和层析的纯化标签；另外，分别在scFv基因的5
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端添加合适的限制性酶切位点，便于后续重组表达载体的构建，将以上基因序列合成scFv基因；（5）scFv重组载体构建及表达：将合成的scFv基因片段和选定的表达载体采用对应的限制性内切酶在合适温度下进行一定时间的酶切反应，采用T4 DNA连接酶在合适温度下反应一定时间进行连接，得到重组表达载体，最后将重组载体转化至合适的感受态细胞，涂Amp-LB培养基平板，在37
°
C条件下过夜培养，挑选单菌落进行PCR及酶切鉴定，对阳性克隆菌进行基因测序确认；将测序正确的scFv重组载体质粒分别转化E.coli BL21（DE3)感受态细胞，涂Amp-LB培养基平板，在37
°
C条件下过夜培养后挑取单菌落，接种至含Amp-LB液体培养基中在一定温度下进行摇床培养，当菌液生长密度达到OD600=0.8时，加入一定终浓度的IPTG，再继续培养一定时间进行诱导表达，离心收集菌体；（6）scFv重组表达蛋白纯化：取适量scFv菌体重悬于缓冲液I中，超声破碎后进行离心，收集离心上清，在
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KTA pure蛋白纯化系统上进行层析柱纯化，最后将含目的蛋白的洗脱液透析至缓冲液II中，收样待用；（7）scFv片段抗体性能验证：采用双抗夹心法验证scFv单链抗体的抗原反应性。
4. 根据权利要求1所述的肌钙蛋白I E13单抗单链抗体的制备方法，其特征在于， 步骤（2）中PCR采用的轻链GSP引物为以下所列引物中的一条或几条并用：VL-primer1: 5
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TCGTTCACTGCCATCAATCTTCCAC 3
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VL-primer2: 5
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GTTCACTGCCATCAATCTTCCACTT 3
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VL-primer3: 5
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GTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC 3
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【专利技术属性】
技术研发人员：邹继华，武强，张莉，杜东芳，贾江花，何进军，方亮，邹炳德，
申请(专利权)人：美康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：