一种β-乳球蛋白兔多克隆抗体的制备方法及免疫分析方法技术

本发明专利技术提供了一种β-乳球蛋白兔多克隆抗体的制备方法及免疫分析方法，所述制备方法主要过程为β-乳球蛋白直接免疫新西兰大耳白兔，经过五次免疫后股动脉取全血，获得β-乳球蛋白抗体血清；通过优化抗体包被量，抗体的稀释倍数，样品缓冲溶液的pH值建立β-乳球蛋白间接竞争ELISA方法。本发明专利技术制备的抗体效价较高，建立的方法灵敏度和特异性较好。建立的方法灵敏度和特异性较好。建立的方法灵敏度和特异性较好。

【技术实现步骤摘要】
一种
β-乳球蛋白兔多克隆抗体的制备方法及免疫分析方法


[0001]本专利技术属于大分子蛋白免疫
，尤其是涉及一种β-乳球蛋白兔多克隆抗体的制备方法及免疫分析方法。

技术介绍

[0002]β-乳球蛋白目前是乳清蛋白中过敏原所占比例最高的，在牛奶中含量约为4.0mg/mL。它是一个多肽链，在鲜牛乳中，以相对分子量为36000的二聚体存在，其单体包含162个氨基酸残基，单体分子量约为18kDa，等电点为5.1-5.3。
[0003]约有80％的人口会出现与β-乳球蛋白相关的食物过敏。它不存在于母乳中，且胃蛋白酶不能将其消化水解，因此可通过胃肠道进入血液循环，具有强致敏性，作为牛乳中的首要过敏成分，刺激婴儿免疫系统的发生超敏反应。现有的β-乳球蛋白多为单克隆抗体，对多克隆抗体的研究较少，有必要研发一种多克隆抗体，以提高抗体的灵敏度以及特异性。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术旨在提出一种β-乳球蛋白兔多克隆抗体的制备方法及免疫分析方法，以提高抗体的灵敏度以及特异性。
[0005]为达到上述目本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β-乳球蛋白兔多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括免疫过程和抗体纯化过程两个步骤；其中免疫过程具体方法为：免疫动物选择兔子，免疫原为β-乳球蛋白，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初次免疫后进行4次加强免疫，分别位于初次免疫后第2、4、6和8周，第5次免疫后采7-10天取全血，收集血清，冻存备用；抗体纯化过程，具体包括如下步骤：1)将该实验中需要用到的所有缓冲液和溶剂都超声10-30min以排除气泡；2)平衡纯化柱：首先用pH 7.4的磷酸缓冲液冲洗管路1-2min，流速设定为5.0-8.0mL/min。冲洗管路后让纯化柱内乙醇自行流出，然后将纯化柱与蛋白纯化仪连接好，用pH 7.4的磷酸缓冲液冲洗柱子，流速设定为0.5-1.5mL/min；观察程序屏幕中紫外和电导两条基线变为平行线时，停止冲柱；3)上样：取0.5-1.5mL待纯化的β-乳球蛋白多克隆抗体血清与磷酸缓冲液等体积稀释后上柱，调整流速设置为0.3-0.8mL/min。纯化仪紫外电导图中会显示出杂蛋白峰；4)洗脱：出现杂蛋白峰后，继续用磷酸缓冲液冲洗柱子，至基线达到平衡后停止。然后用pH 2.7的甘氨酸-盐酸缓冲液冲洗柱子，流速0.3-0.8mL/min，此时与Protein A-Sepharose 4B结合的免疫球蛋白被洗脱下来；5)收集：加入洗脱液后，注意仪器紫外电导图线的变化，当基线开始发生变化时开始收集洗脱液，每个收集管收集约1mL液体，直至曲线不发生变化，停止收集；收集液经分光光度计280nm处读数，弃去吸光度值<0.4的收集液，将吸光度值>0.4的液体混匀后立即用Tris-HCl迅速调节抗体，使其pH至7.0；6)处理纯化柱：待抗体纯化结束后，用0.05-0.20mol/L醋酸迅速冲洗柱子1-3min，流速3-8mL/min，然后再用磷酸盐缓冲液平衡柱子，同时用pH试纸测定流出缓冲液的pH值，直到其显示中性为止。最后用质量浓度为20％乙醇溶液冲洗纯化柱20min，并使柱子中充满20％乙醇溶液，封存于4℃；7)抗体保存方法：将纯化后的β-乳球蛋白抗体倒入超滤装置中进行超滤，重复2-3次，最后一次在液体剩余大概4-5mL时停止超滤，取出液体用分光光度计测定吸光度，与等体积的丙三醇混匀，于-20℃冰箱中保存备用；所述免疫过程具体包括如下步骤：1)初次免疫：免疫原与弗氏完全佐剂以1:1的体积混合，经密封性良好的玻璃注射器乳化，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王世杰，朱宏，
申请(专利权)人：石家庄君乐宝乳业有限公司，
类型：发明
国别省市：