一种促进脐带血干细胞成骨分化的组合物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种促进脐带血干细胞成骨分化的组合物及其应用。本发明专利技术制备获得了骨硬化蛋白特异性的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够特异性的促进干细胞向成骨分化的同时还能够在二种干细胞中弱促进细胞的增殖，具有较好的应用前景。应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种促进脐带血干细胞成骨分化的组合物及其应用


[0001]本专利技术涉及生物领域，具体的涉及一种促进脐带间充质干细胞向成骨分化的方法及其组合物和应用。

技术介绍

[0002]骨相关疾病是近年来发病率升高较快的病种。而骨组织工程的进步为骨缺损修复提供了新的思路，在一定程度上克服了传统骨缺损修复所存在的缺点，如免疫排斥反应、二次损伤、可移植部位及数量有限等。骨组织工程的关键之一是选择合适的种子细胞。近十几年的研究发现，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗80多种疾病。相对于骨髓内的干细胞，进行脐带血干细胞移植所引发的后遗症更低，而且干细胞的排斥概率也低。成骨细胞时骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化形成新骨。成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡4个阶段。很多因素可调节这几个阶段，从而最终调控骨形成。干细胞骨分化是骨骼细胞再生的重要环节，干细胞分化成骨组织用以进行移植研究和潜在治疗具有重要的价值。
[0003]脐带等结构在女性生产后，常作为医疗废弃物处置，这极为可惜，因为脐血有很多具有多向分化能力的干细胞，除了造血干细胞，间充质干细胞也可在体内外分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。
[0004]目前，关于脐带间充质干细胞成骨分化的研究已比较多。许多胞外成分可引导间充质干细胞向成骨细胞分化，如骨形成蛋白2、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子、力生长因子等，但较常用的方法为地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸共同促间充质干细胞成骨分化。其中地塞米松可以促进间充质干细胞碱性磷酸酶活性增强，早期促基质合成，后期促钙化; β-甘油磷酸钠迅速水解生成磷酸根离子，可作为碱性磷酸酶的底物，促进钙盐沉积; 抗坏血酸可以促进细胞合成胶原，形成钙化。有研究表明，干细胞所处的微环境对细胞分化起着正向或者负向调节作用，骨损伤过程的局部为炎性微环境，炎性细胞因子是否对干细胞成骨分化存在促进或抑制作用。有研究表明， IL-10等细胞因子可抑制破骨细胞活性、加速成骨，但是也有研究者提出IL-6 促进破骨细胞增殖和活性。成骨细胞和破骨细胞都是已经分化的细胞，而各类细胞因子是否影响原始的多能间充质干细胞分化成为成骨细胞、对骨修复进行支持是有争议的。研究也表明细胞因子TNF-α， IL-6 和IL-4 在人类脐血来源间充质干细胞的成骨分化中的促进作用。
[0005]此前研究也表明，骨硬化蛋白可通过与Wnt通路中Lrp5/6结合，抑制Wnt/β-catenin通路的活化，对骨形成起负性调控作用。动物实验证明拮抗骨硬化蛋白在增加骨量，改善骨强度和骨折愈合都有很好的效果,通过骨硬化蛋白单链抗体作用与骨髓间充质干细胞，发现对细胞增殖作用不明显，但可以促进成骨分化，为拮抗骨硬化蛋白治疗骨质疏
松症的临床应用提供了新的思路。但是目前，还有拮抗骨硬化蛋白来研究其他干细胞向成骨分化的研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种能够快速促进脐带血干细胞增殖的同时还能促进其诱导分化为成骨细胞的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够快速促进干细胞增殖的同时还能促进其诱导分化为成骨细胞的方法。
[0007]具体的本专利技术针对骨硬化蛋白，筛选获得了特异性的单克隆抗体。
[0008]更具体的，所述单克隆抗体的序列为：轻链可变区(SEQ ID NO:1)DIVITQSPALRAASPGEKSTITCAVRAYISRRYLDWYQQKSGSSPKPWIYSTPNLAAGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMETEDAATYYCQQWSSSPLTFGAGTKLELK重链可变区(SEQ ID NO:2)EVQLEEAGTELARPGAGVKLSCKAAGYIFSQYWAEWIKQRPGRGLEWIGSIYPSQGDTSQTRKFSGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEQSAVYYCAGSNFCADSWGLGTTLAVSS。
[0009]本专利技术提出了一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码前面所述的抗体或其抗原结合片段。
[0010]在本专利技术的另外一个方面，本专利技术提出了一种表达载体，该表达载体包含前面所述的多核苷酸。
[0011]根据本专利技术的具体实施例，上述表达载体进一步包括：控制元件，所述控制元件与所述多核苷酸可操纵地连接，用于控制所述多核苷酸在宿主细胞中的表达。
[0012]在本专利技术的另外一个方面，本专利技术还提出了前面所述的多核苷酸、表达载体、或重组细胞在制备抗体或其抗原结合片段的用途，所述抗体与骨硬化蛋白特异性结合。
[0013]在本专利技术的另外一个方面，本专利技术提出了前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面的多核苷酸、表达载体、重组细胞或前面所述的抗体在制备促进干细胞成骨分化中的用途。
[0014]进一步的，所述干细胞为脂肪干细胞或者脐带血干细胞，或者其他合适的干细胞。
[0015]本专利技术还提供一种促进干细胞增殖以及成骨分化的方法，具体为如下步骤：取分离纯化的干细胞加入成骨诱导液，每3d换液，诱导10-20d即可。采用茜素红染色镜下观察成骨诱导后细胞形态变化。其中成骨诱导液：加终浓度为50ug/mL 骨硬化蛋白特异性单克隆抗体的a-MEM完全培养基。
[0016]在本专利技术的另外一个方面，本专利技术提出了一种药物联合。根据本专利技术的实施例，该药物联合包括： (1)前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面的多核苷酸、前面的表达载体、前面的重组细胞或前面所述的单克隆抗体；以及 (2)与(1)不同的干细胞成骨分化诱导增强药物。
[0017]有益效果本专利技术制备获得了骨硬化蛋白特异性的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够特异性的促进干细胞向成骨分化的同时还能够在二种干细胞中弱促进细胞的增殖，具有较好的应用前
景。
[0018]附图说明
[0019]图1 脐带血间充质干细胞标记物结果图图2 单抗对干细胞成骨基因表达的影响结果图图3 单抗对干细胞增殖的影响结果图
具体实施方式
[0020]下面详细描述本专利技术的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅 用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的， 对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。
[0021]实施例1 脐带血间充质干细胞的制备无菌条件下取健康胎儿小块胎盘组织，PBS充分洗涤后剔取胎儿面脱膜并剪碎。0.1％IV型胶原酶消化20min，100目筛网过滤，收集细胞接种于T75细胞培养瓶，以含10％UCBS的-MEM培养基于37，5％CO2的饱和湿度环境下进行培养。培养生长至80％融合后，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种骨硬化蛋白的单克隆抗体，其特征在于具体的轻重链可变区序列为：轻链可变区(SEQ ID NO:1)DIVITQSPALRAASPGEKSTITCAVRAYISRRYLDWYQQKSGSSPKPWIYSTPNLAAGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMETEDAATYYCQQWSSSPLTFGAGTKLELK重链可变区(SEQ ID NO:2)EVQLEEAGTELARPGAGVKLSCKAAGYIFSQYWAEWIKQRPGRGLEWIGSIYPSQGDTSQTRKFSGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEQSAVYYCAGSNFCADSWGLGTTLAVSS。2.编码权利要求1所述骨硬化蛋白单克隆抗体的多核苷酸。3.含有权利要求2所述多核苷酸的表达载体。4.权利要求1所述的单克隆抗体在制备促进脐带血间充质...

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，陈博，
申请(专利权)人：天津汉青生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：