一种检测人Circ-E-cad蛋白的ELISA试剂盒及其应用方法技术

本发明专利技术公开了一种检测人Circ‑E‑cad蛋白的ELISA试剂盒，具体工作液配置如下：标准品液6瓶(1ml/瓶)，酶标记物7ml，抗体工作液7ml，底物A液7ml，底物B液7ml，终止液7ml，20X浓缩洗涤液40ml，样本稀释液50ml，抗原包被的酶标板。本发明专利技术还公开了该试剂盒的应用方法。本发明专利技术通过制备特异性检测Circ‑E‑cad蛋白的小鼠来源的单克隆抗体开发了检测人Circ‑E‑cad蛋白的ELISA试剂盒，试剂盒提供目标分子检测的所有工作液，可用于对人临床样品中Circ‑E‑cad蛋白的定量检测，试剂盒具有特异性强、重复性好、灵敏度高的特点，可快速实现样品中目标蛋白的定量检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测人Circ-E-cad蛋白的ELISA试剂盒及其应用方法
本专利技术涉及一种ELISA试剂盒及其应用方法，属于分子生物学蛋白检测领域，特别涉及一种检测人Circ-E-cad蛋白的ELISA试剂盒及其应用方法。
技术介绍
自2012年以来，在生物体内陆续发现了大量存在的环状的RNA(circulaRNA，circRNA)，生物体内的环状RNA是一类具有特殊功能的RNA，而且是客观大量存在的。环状RNA由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成。以前的研究由于技术水平的限制，没有发现这部分环状RNA的客观存在，随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生物体内大量存在环状的RNA分子，环状RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。对于环状RNA的具体功能和作用分子机制的研究报道较少，目前只有几种假定的说法：环状RNA可以作为“sponge”海绵吸miRNA，抑制其功能；环状RNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平；环状RNA能与蛋白质结合,抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性，环状RNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成。前期工作中，通过核糖体印迹与深度测序技术(RibosomeProfilingandDeepSequencing)结合生物信息学分析，发现了一批在恶性胶质瘤中差异表达并且具有潜在翻译能力的环状RNA候选分子。结合环状RNA数据库Circbase进一步的分析发现，环状RNACirc-E-cad-733nt在肿瘤和配对的瘤旁正常脑组织中差异表达最明显，Circ-E-cad-733nt在瘤旁正常脑组织中表达非常微弱或不表达，只在恶性胶质瘤组织中特异性高表达，通过制备抗体及蛋白质谱鉴定Circ-E-cad-733nt翻译了一个由254个氨基酸组成的新的蛋白质Circ-E-cad。在肿瘤研究及临床检测中，聚焦新发现的蛋白，能进一步加深我们肿瘤发生发展的理解，针对这些新的蛋白分子靶点设计新的检测方法，具有潜在的临床应用价值。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术目的是提供一种检测人Circ-E-cad蛋白的ELISA试剂盒及应用方法，通过制备特异性检测Circ-E-cad蛋白的小鼠来源的单克隆抗体开发了检测人Circ-E-cad蛋白的ELISA试剂盒，可用于对人临床样品中Circ-E-cad蛋白的定量检测。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供一种检测人Circ-E-cad蛋白的ELISA试剂盒，具体工作液配置如下：(1)标准品液6瓶(1ml/瓶)，用制备单克隆抗体的多肽偶联人血清白蛋白BSA分子作为标准品，配置的样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01mol/L的磷酸盐溶液，最终用酸碱调节PH为7.0；取标准品，然后用样品稀释液配置梯度浓度的标准品0μg/ml、2μg/ml、6μg/ml、18μg/ml、54μg/ml、162μg/ml；(2)酶标记物7ml：本试剂盒中用到的酶标记物为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠的IgG免疫球蛋白，用0.01M浓度的PBS将IgG配置成最浓度为4μg/ml，作为本试剂盒中的酶标记物；(3)抗体工作液7ml：本试剂盒中用到的抗体工作液为小鼠抗Circ-E-cad的单克隆抗体，用0.01M浓度的PBS配置成0.5μg/ml的终浓度作为本试剂盒的抗体工作液；(4)底物A液7ml：称取TMB四甲基联苯胺0.1g，加入无水乙醇100ml，加灭菌去离子水至1L，充分混匀，分装出7ml，作为本试剂盒的底物A液；(5)底物B液7ml：磷酸氢钠1.5g，柠檬酸0.95g，0.75％过氧化氢尿素0.65ml，加灭菌去离子水到100ml，调PH到5.2-5.5，分装出7ml，作为本试剂盒的底物B液；(6)终止液7ml：终止液为浓度1mol/L的硫酸；(7)20X浓缩洗涤液40ml：含1％的吐温-20磷酸盐缓冲液，浓度为0.2mol/L；(8)样本稀释液50ml：样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01mol/L的磷酸盐溶液，最终用酸碱调节PH为7.0；(9)抗原包被的酶标板：用0.1M浓度的碳酸盐缓冲液作为稀释液，将偶联BSA的多肽抗原稀释成10μg/ml的浓度，取100μl加入到酶标板孔中，4℃包被过夜，甩干，按照100μl/孔加入1％明胶，用磷酸盐缓冲液37℃孵育1小时，真空低温干燥，然后抽真空包装在锡箔纸带中，密封，2-8度冰箱存放。进一步地，采用间接竞争ELISA方法，在微孔条孔上预包被偶联BSA多肽抗原，检测样本中的Circ-E-cad蛋白与微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗体，用四甲基联苯胺底物显色，样本吸光值与其所含Circ-E-cad蛋白的的含量成负相关。进一步地，(3)中所述小鼠抗Circ-E-cad单克隆抗体特异性识别并结合Circ-E-cad蛋白C末端的氨基酸序列TNLCDGGHSHRRGR；所述Circ-E-cad蛋白由环状RNACirc-E-Cad-733n转录而成；所述环状RNACirc-E-Cad-733n的核苷酸序列如SEQID.No.1所示；所述Circ-E-cad蛋白的氨基酸序列如SEQID.No.2所示。进一步地，(3)中所述的小鼠抗Circ-E-cad单克隆抗体，通过以下制备方法制成：3.1)根据环状RNACirc-E-Cad-733n的核苷酸序列SEQID.No.1，预测翻译得到Circ-E-cad蛋白的氨基酸序列如SEQID.No.2所示；3.2)根据Circ-E-cad蛋白的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方法，合成特异性针对Circ-E-Cad蛋白的多肽TNLCDGGHSHRRGR氨基酸序列，多肽偶联钥孔血蓝蛋白作为免疫原；3.3)多肽偶联钥孔血蓝蛋白免疫小鼠，制备杂交瘤细胞系；3.4)将测定阳性的杂交瘤细胞做扩大细胞培养，生产小鼠抗Circ-E-cad单克隆抗体。更进一步地，步骤3.3)中，所述免疫小鼠，制备杂交瘤细胞系具体步骤为：3.3.1)免疫动物：使用BALB/c雌性小鼠，8-10周龄；用50μg偶联钥孔血蓝蛋白的多肽TNLCDGGHSHRRGR和50μl免疫佐剂免疫小鼠5次，分时间点为d0、d21、d42、d63、d8；取103天后血清进行ELISA检测抗体效价；3.3.2)细胞融合：处死小鼠，无菌操作取出脾脏，制备脾细胞悬液；将脾细胞和骨髓瘤细胞按照1：10的比例混合，并加入聚乙二醇，细胞融合形成杂交瘤细胞；3.3.3)单克隆测试：10-14天后，当肉眼可见细胞克隆，部分孔培养基开始变黄时，用酶联免疫吸附试验检测所有孔，再过3天，对第一次ELISA鉴定的阳性克隆进行ELISA检测，再过3天，对第二次ELISA鉴定的阳性克隆进行ELISA检测，将测定阳性的细胞做扩大细胞培养用于大量生产单克隆抗体。更进一步地，步骤3.3.2)中，所述加入聚乙二醇以每3×108混合细胞缓慢本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测人Circ-E-cad蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于，具体工作液配置如下：/n(1)标准品液6瓶(1ml/瓶)，用制备单克隆抗体的多肽偶联人血清白蛋白BSA分子作为标准品，配置的样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01mol/L的磷酸盐溶液，最终用酸碱调节PH为7.0；取标准品，然后用样品稀释液配置梯度浓度的标准品0μg/ml、2μg/ml、6μg/ml、18μg/ml、54μg/ml、162μg/ml；/n(2)酶标记物7ml：本试剂盒中用到的酶标记物为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠的IgG免疫球蛋白，用0.01M浓度的PBS将IgG配置成最浓度为4μg/ml，作为本试剂盒中的酶标记物；/n(3)抗体工作液7ml：本试剂盒中用到的抗体工作液为小鼠抗Circ-E-cad的单克隆抗体，用0.01M浓度的PBS配置成0.5μg/ml的终浓度作为本试剂盒的抗体工作液；/n(4)底物A液7ml：称取TMB四甲基联苯胺0.1g，加入无水乙醇100ml，加灭菌去离子水至1L，充分混匀，分装出7ml，作为本试剂盒的底物A液；/n(5)底物B液7ml：磷酸氢钠1.5g，柠檬酸0.95g，0.75％过氧化氢尿素0.65ml，加灭菌去离子水到100ml，调PH到5.2-5.5，分装出7ml，作为本试剂盒的底物B液；/n(6)终止液7ml：终止液为浓度1mol/L的硫酸；/n(7)20X浓缩洗涤液40ml：含1％的吐温-20磷酸盐缓冲液，浓度为0.2mol/L；/n(8)样本稀释液50ml：样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01mol/L的磷酸盐溶液，最终用酸碱调节PH为7.0；/n(9)抗原包被的酶标板：用0.1M浓度的碳酸盐缓冲液作为稀释液，将偶联BSA的多肽抗原稀释成10μg/ml的浓度，取100μl加入到酶标板孔中，4℃包被过夜，甩干，按照100μl/孔加入1％明胶，用磷酸盐缓冲液37℃孵育1小时，真空低温干燥，然后抽真空包装在锡箔纸带中，密封，2-8度冰箱存放。/n...

【技术特征摘要】
1.一种检测人Circ-E-cad蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于，具体工作液配置如下：
(1)标准品液6瓶(1ml/瓶)，用制备单克隆抗体的多肽偶联人血清白蛋白BSA分子作为标准品，配置的样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01mol/L的磷酸盐溶液，最终用酸碱调节PH为7.0；取标准品，然后用样品稀释液配置梯度浓度的标准品0μg/ml、2μg/ml、6μg/ml、18μg/ml、54μg/ml、162μg/ml；
(2)酶标记物7ml：本试剂盒中用到的酶标记物为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠的IgG免疫球蛋白，用0.01M浓度的PBS将IgG配置成最浓度为4μg/ml，作为本试剂盒中的酶标记物；
(3)抗体工作液7ml：本试剂盒中用到的抗体工作液为小鼠抗Circ-E-cad的单克隆抗体，用0.01M浓度的PBS配置成0.5μg/ml的终浓度作为本试剂盒的抗体工作液；
(4)底物A液7ml：称取TMB四甲基联苯胺0.1g，加入无水乙醇100ml，加灭菌去离子水至1L，充分混匀，分装出7ml，作为本试剂盒的底物A液；
(5)底物B液7ml：磷酸氢钠1.5g，柠檬酸0.95g，0.75％过氧化氢尿素0.65ml，加灭菌去离子水到100ml，调PH到5.2-5.5，分装出7ml，作为本试剂盒的底物B液；
(6)终止液7ml：终止液为浓度1mol/L的硫酸；
(7)20X浓缩洗涤液40ml：含1％的吐温-20磷酸盐缓冲液，浓度为0.2mol/L；
(8)样本稀释液50ml：样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01mol/L的磷酸盐溶液，最终用酸碱调节PH为7.0；
(9)抗原包被的酶标板：用0.1M浓度的碳酸盐缓冲液作为稀释液，将偶联BSA的多肽抗原稀释成10μg/ml的浓度，取100μl加入到酶标板孔中，4℃包被过夜，甩干，按照100μl/孔加入1％明胶，用磷酸盐缓冲液37℃孵育1小时，真空低温干燥，然后抽真空包装在锡箔纸带中，密封，2-8度冰箱存放。


2.根据权利要求1所述的检测人Circ-E-cad蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：采用间接竞争ELISA方法，在微孔条孔上预包被偶联BSA多肽抗原，检测样本中的Circ-E-cad蛋白与微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗体，用四甲基联苯胺底物显色，样本吸光值与其所含Circ-E-cad蛋白的的含量成负相关。


3.根据权利要求1所述的检测人Circ-E-cad蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：
(3)中所述小鼠抗Circ-E-cad单克隆抗体特异性识别并结合Circ-E-cad蛋白C末端的氨基酸序列TNLCDGGHSHRRGR；所述Circ-E-cad蛋白由环状RNACirc-E-Cad-733n转录而成；所述环状RNACirc-E-Cad-733n的核苷酸序列如SEQID.No.1所示；所述Circ-E-cad蛋白的氨基酸序列如SEQID.No.2所示。


4.根据权利要求1所述的检测人Circ-E-cad蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于，(3)中所述的小鼠抗Circ-E-cad单克隆抗体，通过以下制备方法制成：
3.1)根据环状RNACirc-E-Cad-733n的核苷酸序列SEQID.No.1，预测翻译得到Circ-E-cad蛋白的氨基酸序列如SEQID.No.2所示；
3.2)根据Circ-E-cad蛋白的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方法，合成特异性针对Circ-E-Cad蛋白的多肽TNLCDGGHSHRRGR氨基酸序列，多肽偶联钥孔血蓝蛋白作为免疫原；
3.3)多肽偶联钥孔血蓝蛋白免疫小鼠，制备杂交瘤细胞系；
3.4)将测定阳性的杂交瘤细胞做扩大细胞培养，生产小鼠抗Circ-E-cad单克隆抗体。


5.根据权利要求4所述的检测人Circ-E-cad蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于，步骤3.3)中，所述免疫小鼠，制备杂交瘤细胞系具体步骤为：
3.3.1)免疫动物：使用BALB/c雌性小鼠，8-10周龄；用50μg偶联钥孔血蓝蛋白的多肽TNLCDGGHSHRRGR和50μl...

【专利技术属性】
技术研发人员：张弩，
申请(专利权)人：中山大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：广东;44