一种生产重组蛋白酶K的方法技术

本发明专利技术涉及蛋白酶K的重组表达载体、具有所述重组表达载体的宿主细胞以及生产重组蛋白酶K的方法。本发明专利技术通过设计表达载体，实现重蛋白酶K的高效表达，再采用优化的纯化方法对目标蛋白进行提纯，大幅缩短了目标蛋白的纯化流程与纯化时间，同时提高了目标蛋白的纯度、得率和酶活，节省实验步骤并减少成本。本发明专利技术为研发与生产蛋白酶K类似的或者其他蛋白类工具酶奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种生产重组蛋白酶K的方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种生产重组蛋白酶K的方法。
技术介绍
蛋白酶K(EC3.4.21.14)来源于林伯氏白色念球菌(TritirachiumalbumLimber)，是一种与枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶,由于它能降解角蛋白(keratin)，因此被命名为蛋白酶K。蛋白酶K由一条肽链组成，包含277个氨基酸残基，相对分子质量为28930,活性部位由D39、H69和S224组成，底物识别位点主要为G100-Y104和S132-G136两个片段。蛋白酶K包含两个二硫键(C34-C124，C179-C248)，两个色氨酸残基(W8，W212)和一个游离半胱氨酸(C73)。X射线晶体学研究表明，蛋白酶K的三维结构为一个明确的球形折叠。蛋白酶K属于α/β类蛋白质，包含6个α-螺旋，15个β-折叠和一个3/10螺旋。蛋白酶K是一种高活性的广谱蛋白酶，蛋白酶K对天然蛋白质和非天然蛋白质都有较高的蛋白水解活性，并且这种酶在含有尿素或十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfonate，SDS)的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白酶K的重组表达载体，其特征在于，在pPICZαA载体质粒中插入了编码蛋白酶K的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.蛋白酶K的重组表达载体，其特征在于，在pPICZαA载体质粒中插入了编码蛋白酶K的核苷酸序列。


2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述蛋白酶K为林伯氏白色念球菌的蛋白酶K；
优选地，所述编码蛋白酶K的核苷酸序列经过密码子优化；
优选地，所述编码蛋白酶K的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。


3.根据权利要求1或2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中还插入了编码蛋白标签的核苷酸序列，所述蛋白标签优选为His标签。


4.具有权利要求1～3任意一项所述重组表达载体的宿主细胞；
优选地，所述宿主细胞为酵母，优选为毕赤酵母。


5.利用权利要求1～3任意一项所述重组表达载体或权利要求4所述宿主细胞生产重组蛋白酶K的方法。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将转入了所述重组表达载体的宿主细胞，涂布于博来霉素抗性的平板培养基上，培养过夜；
(2)挑取单菌落置于博来霉素抗性的液体培养基中培养，加入诱导剂诱导蛋白表达，得发酵液；
(3)对所述发酵液进行过滤，去除菌体，收集上清，纯化。

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【专利技术属性】
技术研发人员：汪本助，徐斌，王舒，
申请(专利权)人：安徽丰原发酵技术工程研究有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34