一种TXNDC16基因在制备检测肺癌化疗药耐药性检测试剂盒中的应用，属于基因突变技术领域，为了探究TXNDC16基因与肺癌化疗药耐药性的关系，本发明专利技术提供了一种TXNDC16基因在制备检测肺癌化疗药耐药检测试剂盒中的应用，是将TXNDC16基因下游序列经插入突变后用于检测肺癌化疗药耐药性；所述插入突变是指所述TXNDC16基因下游30,655bp处插入外源基因，所述外源基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术可用于肺癌化疗药耐药性检测。发明专利技术可用于肺癌化疗药耐药性检测。发明专利技术可用于肺癌化疗药耐药性检测。
【技术实现步骤摘要】
Perturbation Technology，CRGP)是本课题申请人基于整合转座子插入突变技术、反义RNA技术和真核基因表达调控技术专利技术的一种功能基因组学技术。CRGP能产生全基因组纯合基因突变；提供全基因组基因筛选和基因功能分析；同时发现并证实其基因突变和功能表达的关系；系统性基因功能定位和分析其在遗传和生化通路中的功能特点；快速分离与疾病有关基因和变阻器式基因表达调控。利用该技术或基于该技术原理已成功地筛选和鉴定出与许多重大疾病相关的基因和信号转导通路，包括肿瘤形成、肿瘤耐药分子机理、癌症侵袭和转移、流感病毒病理机制和老年性痴呆症病理机制研究。
技术实现思路
[0005]为了探究TXNDC16基因与肺癌化疗药耐药性的关系，本专利技术提供了一种TXNDC16基因在制备检测肺癌化疗药耐药性检测试剂盒中的应用。
[0006]进一步地限定，所述化疗药物为顺铂。
[0007]进一步地限定，所述TXNDC16基因核苷酸序列GenBank登录号为NM_020784。
[0008]进一步地限定，所述应用是指将TXNDC16基因下游序列经插入突变后用于制备检测肺癌化疗药耐药性检测试剂盒。
[0009]进一步地限定，所述插入突变是指所述TXNDC16基因下游30,655bp处插入外源基因。
[0010]进一步地限定，所述外源基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0011]有益效果
[0012]本专利技术利用随机基因突变调控的方法筛选控制肺癌细胞耐受顺铂的关键基因，可应用于制备检测肺癌化疗药耐药检测试剂盒。
附图说明
[0013]图1细胞生长曲线，横坐标为药物剂量，纵坐标为吸光度值OD450；
[0014]图2Tet-off克隆的筛选，荧光素酶报告基因检测相对光单位的变化倍数，横坐标为Tet-off克隆编号，纵坐标为调控倍数；
[0015]图3候选4个Tet-off克隆细胞株受DOX调控特性比较；
[0016]图4候选耐受顺铂的突变克隆CIS4的IC50检测，横坐标为药物剂量，纵坐标为吸光度值OD450；
[0017]图5GSV插入两端的DNA测序结果。
具体实施方式
[0018]本专利技术的技术原理为：通过基于能在真核细胞中高效整合的piggyBac转座子(GI：226433913)构建基因搜寻载体(gene search vector，GSV)，将其随机插入基因组，其中GSV所携带的四环素反应元件(TRE，GI：76667907)优选为利用两段四环素反应元件拼接得到，这样转录激活因子对其的激活作用更强，启动转录的距离更远，能够受到转录激活因子tTA的激活，piggbac转座子在真核细胞中能高效整合，并且整合位点偏向于编码基因，并且在插入基因组后可以通过转座酶进行无痕切除，这些都符合一个理想的基因搜寻载体的要求。在tTA的作用下，GSV中的14Tet能够很强地启动附近DNA序列的转录；若转录出的RNA与
上游基因转录方向相反，则可得到反义RNA，与上游基因的mRNA结合从而阻止该基因的翻译表达；若方向相同，则可过表达下游基因，故通过该载体可将插入位点附近的基因突变。
[0019]GSV中还可以包含新霉素抗性基因，该抗性基因在真核细胞中可以利用G418筛选阳性克隆，在原核细胞表现为卡那霉素抗性，用于筛选阳性菌落。当然，所述GSV中的抗性基因可以为任何适于可以在真核细胞和原核细胞中分别进行抗性筛选的原件。此外，转录激活因子tTA与TRE的结合还受到四环素类药物例如强力霉素(Doxcyclin)的调控，通过添加或者不添加DOX可以人为的调控tTA是否激活TRE启动转录，从而能够同时发现并证实其基因突变和功能表达的关系，故是一种突变调控技术。本领域技术人员熟知，为了实现或更好地实现本专利技术的目的，本专利技术的基因搜寻载体还可以包含质粒复制起点，该质粒复制起点并无特殊要求，只要其能有效起始质粒在相应宿主中的复制即可，如p15A复制子；利于外源片段插入的多克隆位点；调控目标基因转录翻译的四环素反应元件，如TRE；能在真核细胞中随机整合的转座子，如PiggyBac；利于在原核系统中筛选阳性菌落的氨苄青霉素抗性基因；能有效启动基因搜寻载体在宿主细胞中转录翻译的启动子，如P-CMV；以及其他质粒常见元件，如增强子、便于基因表达检测的荧光蛋白基因、终止子，等。
[0020]本领域技术人员公知，在保证实现基因搜寻的目的的前体下，所述基因搜寻载体还可以包含其他功能元件，所述功能元件均被有效连接，以实现在原核宿主细胞中被复制、扩增、检测、筛选、分离或纯化，和/或在真核宿主细胞中被复制、扩增、与宿主基因组整合、转录、翻译、检测、筛选、分离或纯化的目的。同时，本领域技术人员公知，在保证实现基因搜寻的目的的前提下，所述基因搜寻载体的组成元件的顺序可以进行适当地调整，例如，所述原核抗性基因和真核抗性基因的位置可以相互调换。这样的变形也包括在本专利技术的范围内。
[0021]本领域技术人员理解，本专利技术所述基因搜寻载体内所使用的各个组成元件均是本领域公知的作用元件，其具体的核苷酸序列可以方便地在本领域公知的数据库中找到并适用。
[0022]本专利技术所述方法获得的全基因组随机突变文库随机产生且突变性状能够遗传，包含的突变的基因从概率上覆盖了整个基因组，可以应用于筛选待检测的作用于目标性状的控制基因或信号通路，所述目标性状例如但不限于加速肿瘤细胞转移、降低肿瘤细胞转移及筛选肿瘤发生、耐药等，也可通过流式细胞术FACS筛选细胞表面表达某种特异性分子标记的细胞。
[0023]下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本专利技术，本领域技术人员公知，在不背离本专利技术精神的情况下，可以对本专利技术做出许多修改，这样的修改也落入本专利技术的范围。
[0024]下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
[0025]主要实验材料:
[0026]限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司，引物、测序、Taq聚合酶均购自Invitrogen公司，质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司，，胎牛血清、DMEM培养基、PBS购自Hyclone公司，FugenHD购自Roche公司，各种细胞培养耗材均购自Corning公司，嘌呤霉素(puromycin)、Luciferin底物购自Invivo公司，新霉素(neomyicn，G418)购自Merck公司。
[0027]本专利技术所述基于PiggyBac的基因搜寻载体GSV，质粒(CAG-tTA)、MPB质粒(该质粒表达mPB酶)记载在已公开的专利CN102747096A专利技术名称为《基因搜寻载体、随机基因突变调控方法及用途》，公众可通过中国人民解放军总医院第三医学中心获得。
[0028]pUHD13-3质粒，记载在Gossen，M.，A.L.Bonin，and H.Bujard.1994.Control ofgene activity in higher eukaryo本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种TXNDC16基因在制备检测肺癌化疗药耐药性检测试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化疗药物为顺铂。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述TXNDC16基因核苷酸序列GenBank登录号为NM_020784。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是指...
【专利技术属性】
技术研发人员：常德，D，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院第三医学中心，
类型：发明
国别省市：
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