一种重组人源III型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统技术方案

本发明专利技术公开了一种重组人源III型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统。本发明专利技术将人源III型胶原蛋白部分肽段中含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸的Gly

【技术实现步骤摘要】
一种重组人源III型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及利用毕赤酵母表达重组人源III型胶原蛋白。

技术介绍

[0002]胶原蛋白(collagen)是体内含量最多的一种蛋白质，是细胞外基质(ECM)的主要成分，其对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复具有重要作用，已广泛应用于医药、保健品及化妆品行业中。在分子结构上，每条胶原肽链主要由Gly
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X
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Y结构肽构成(X、Y是Gly之外的任何氨基酸残基)，这种肽链结构是形成胶原纤维高级结构所必需的，决定了胶原蛋白优良的生物相容性和低免疫原性。
[0003]胶原蛋白的主要来源是从动物组织中提取，而随着生物技术的发展，利用基因重组技术，通过微生物发酵法获得重组胶原蛋白，解决了传统提取法存在的病毒隐患，同时与天然胶原蛋白相比，人工设计的重组胶原蛋白的亲水性和生物相容性显著提高。但研究表明利用重组菌株，例如，毕赤酵母基因工程菌表达胶原蛋白时，在发酵过程中重组菌株表达的胶原蛋白会出现明显的降解现象，不利于后续的纯化及应用，同时也提高了胶原蛋白的生产消耗和成本。
[0004]中国专利CN111647089A公开了一种重组类人弹性蛋白及其组合物，通过短重复氨基酸序列串联(重复3～7次)构成目的蛋白多肽序列，具有较好的耐降解性能，催化活性较单一原始片段保持更久。但是短重复氨基酸序列串联导致重组蛋白与天然蛋白序列同源性降低，并不适合作为与生物体长期接触的生物材料进行应用。
[0005]中国专利CN109680025A公开了一种提高重组人源胶原蛋白生产水平且降低蛋白降解速度的发酵工艺，其在甲醇诱导培养阶段(90～120小时)向发酵培养基中加入柠檬酸铵，可以提高重组人源胶原蛋白的生物合成速率，缩短发酵时间，同时也提高了重组人源胶原蛋白在发酵液中的稳定性。但随着重组人源蛋白与发酵液分离，仍无法解决重组人源胶原蛋白在下游纯化过程及应用过程中的稳定性问题。
[0006]中国专利CN103102407A中提供了一种酵母基因工程菌，其可以表达带有特异性亲和纯化标记和两段相同的人源III型胶原蛋白片段的基因重组类人胶原蛋白。该专利采用与天然胶原的部分肽段序列完全相同的两段序列(通过EFT连接)构建重组蛋白，但从结果电泳图中可以看出目的蛋白附近有明显的降解片段。同时，虽然使用特异性纯化标记可获得纯度较高的目的蛋白，但纯化标记会影响蛋白的免疫原性，从而影响蛋白的应用。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种重组人源III型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
[0009]一种重组人源III型胶原蛋白，该重组人源III型胶原蛋白包括重复串联的单体，所述单体为突变的人源III型胶原蛋白氨基酸序列片段，单体的突变位点为人源III型胶原
蛋白氨基酸序列片段中含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸的Gly
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X
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Y结构肽(三肽重复序列)。
[0010]优选的，所述单体为由50～500个氨基酸构成的肽段，突变的Gly
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X
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Y结构肽数与单体的Gly
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X
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Y结构肽总数的数量比为小于10％(例如，2％～8％)。
[0011]优选的，根据人源III型胶原蛋白氨基酸序列，选取该序列中第538至705位的168位氨基酸残基所组成的肽段，然后将该肽段中含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸的Gly
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X
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Y结构肽作为突变位点进行优化，即将这些Gly
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X
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Y结构肽以使用频率较高且不含有上述氨基酸(缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸)的Gly
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X
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Y结构肽替换，并以优化后形成的168位氨基酸残基所组成的肽段作为重复串联表达的单体。
[0012]优选的，所述单体的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1自氨基端起的第2～169位。
[0013]优选的，所述重组人源III型胶原蛋白中，单体的串联个数为2～10(例如，二重复串联单体、四重复串联单体、六重复串联单体)。
[0014]优选的，所述重组人源III型胶原蛋白的分子量为10KD～100KD。
[0015]一种重组人源III型胶原蛋白的表达系统，该表达系统包括表达重组人源III型胶原蛋白的菌株，该菌株是转化有重组人源胶原蛋白基因分泌型表达载体的野生型或突变型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，所述分泌型表达载体包括重组人源胶原蛋白基因表达盒，所述表达盒包括启动子(例如，醇氧化物酶启动子)、目的基因序列和终止区序列(例如，TT)，所述目的基因序列是由KEX2酶切位点、人源III型胶原蛋白氨基端(N端)第一个氨基酸的编码序列(甘氨酸的密码子，例如GGT)以及与该序列紧邻的用于对上述单体进行重复串联表达的多段重复编码序列(例如，二重复、四重复、六重复)和终止密码子(例如，TGATAA)组成的DNA序列。
[0016]优选的，所述单体的编码序列为SEQ.ID.NO.2自5
’
端起的第16～519位。
[0017]一种重组人源III型胶原蛋白的生产方法，包括以下步骤：
[0018]1)表达载体的构建：人工全基因合成如SEQ.ID.NO.2所示的DNA序列，该DNA序列在5
’
端添加有Xho I限制性内切酶酶切位点和KEX2酶切位点以及Xba I限制内切酶酶切位点，在3
’
端添加有Nhe I限制性内切酶酶切位点和EcoR I限制性内切酶酶切位点(且二者之间用终止密码子间隔)；将SEQ.ID.NO.2所示的DNA序列连接至克隆载体(例如，pMD19
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T simple等T载体)中，得到单体基因的克隆载体(例如，T
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IIICOL质粒)；将单体基因的克隆载体进行Nhe I/EcoR I双酶切，并回收载体片段，另将单体基因的克隆载体进行Xba I/EcoR I双酶切，回收目的基因片段(含有单体的编码序列和终止密码子)，之后将回收的载体片段与目的基因片段进行连接、转化，获得含有二段重复的单体编码序列的克隆载体(例如，T
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IIICOL
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2质粒)，以此类推(即利用质粒酶切获得切除了终止密码子的载体片段和待增加的目的基因片段)，可获得不同的含有多段重复编码序列(例如，含有二段重复的单体编码序列、含有四段重复的单体编码序列、含有六段重复的单体编码序列)的克隆载体；将这些克隆载体分别利用Xho I/EcoR I进行双酶切，并将回收的含有不同重复数量的单体编码序列的目的基因序列(例如，二重复片段IIICOL
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2、四重复片段IIICOL
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人源III型胶原蛋白，其特征在于：该重组人源III型胶原蛋白包括重复串联的单体，所述单体为突变的人源III型胶原蛋白氨基酸序列片段，单体的突变位点为人源III型胶原蛋白氨基酸序列片段中含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸的Gly
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X
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Y三肽重复序列。2.根据权利要求1所述一种重组人源III型胶原蛋白，其特征在于：所述单体由50～500个氨基酸构成，突变的Gly
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X
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Y三肽重复序列的数量比小于10％。3.根据权利要求1所述一种重组人源III型胶原蛋白，其特征在于：所述单体是将人源III型胶原蛋白氨基酸序列第538至705位氨基酸位点中含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸的Gly
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X
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Y三肽重复序列以使用频率较高且不含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸及丙氨酸的Gly
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X
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Y三肽重复序列替换后得到的。4.根据权利要求1所述一种重组人源III型胶原蛋白，其特征在于：所述单体的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1的第2～169位。5.根据权利要求1所述一种重组人源III型胶原蛋白，其特征在于：所述重组人源III型胶原蛋白中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨鹭，黄文涛，
申请(专利权)人：西安德诺海思医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：