用于癌症诊断和治疗的方法和组合物技术

本发明专利技术涉及表达纤连蛋白额外结构域B(EDB)的疾病的诊断和治疗，如以组织重塑和/或血管生成为特征的疾病，特别是癌性疾病，如头颈癌、脑癌、结肠直肠癌、肺癌、前列腺和乳腺癌。更特别地，本发明专利技术涉及靶向纤连蛋白额外结构域B的肽。B的肽。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于癌症诊断和治疗的方法和组合物


[0001]本专利技术涉及表达纤连蛋白额外结构域B(EDB)的疾病的诊断和治疗，如以组织重塑和/或血管生成为特征的疾病，特别是癌性疾病，如头颈癌、脑癌、结肠直肠癌、肺癌、前列腺和乳腺癌。更特别地，本专利技术涉及靶向纤连蛋白额外结构域B的肽。

技术介绍

[0002]癌症是超越心脏病的全球主要死亡原因之一。2012年，全球有820万人死于癌症。经典的抗癌疗法，例如放射疗法、化学疗法和常规外科手术，经常遭受选择性差的困扰，因此对健康组织有严重的毒副作用。新的治疗形式包括通过对肿瘤相关抗原具有特异性的结合分子将生物活性分子(药物、细胞因子、放射性核素等)靶向递送至肿瘤环境。这会允许药物选择性地指向靶标阳性的肿瘤组织，并且有效地杀死恶性细胞而不损害健康细胞。这伴随着所谓的伴随诊断的发展，使得能够确定患者体内靶标阳性的肿瘤，以便提前保证对个体癌症疗法的合理定制策略。在这方面，靶标特异性成像技术的应用已成为重要的诊断步骤，在过去几十年显示了引人注目的进步。成像技术可以提供关于肿瘤相关蛋白的存在和量、定位、早期检测、分布、患者分层和治疗监测的重要信息。肿瘤成像代表诊断癌症和监测癌症治疗中治疗成功的基础过程。数十年来，已常规使用长期建立的技术，如计算机断层扫描或磁共振成像。但是，由于靶向分子成像利用针对癌症相关蛋白的分子试剂精确地可视化肿瘤，因此引起了更多关注。因此在肿瘤血管生成期间出现的生物标志物非常有帮助，因为它们通常在血管中高水平表达，因此可以很容易地从血流中获得。
[0003]纤连蛋白(FN)是胞外基质的二聚体二硫键糖蛋白，由I型、II型和III型结构域组成。该蛋白有助于许多生理过程，包括细胞粘附、迁移、分化和止血。FN表达为衍生自初级转录本的多个可变剪接变体。同种型额外结构域B(EDB)包含额外的91个氨基酸的III型结构域，其特异性地插入FN结构域7和8之间。这个高度保守的纤连蛋白额外结构域B序列在小鼠、大鼠、兔和人中均相同。纤连蛋白额外结构域B通常在正常的成人组织中不存在，但是参与组织重塑和血管生成。此外，已在许多不同癌症类型中发现了纤连蛋白额外结构域B，其在几种侵袭性实体人类肿瘤(如头部和颈部、脑和乳腺)的新生血管中具有丰富的表达模式。
[0004]为了靶向不良血管化的肿瘤，大尺寸的抗体甚至其片段可能减慢组织渗透的速度，从而阻碍有效的递送。此外，因为抗体的血液循环延长，它们看来不是用于诊断用途的最佳方法，尤其是在成像概念的情况下。除了上述情况，具有复杂糖基化模式和二硫键的抗体分子结构需要复杂的成本密集型生产，并且使进一步的功能化变得复杂，例如通过成像示踪剂。为了克服这些限制，在过去几十年中出现了一种替代抗体的方法，即所谓的蛋白支架：支架提供强大的结构框架以精确地设计为给定靶标的紧密和特异性识别定制的相互作用分子。它们中的大多数在非还原条件下正确折叠，并且可以在细菌中表达而不需要变性和重新折叠。甚至化学合成也是生产某些形式的一种选项。最后，它们非常适合进一步功能化(标记、寡聚化、与其他肽融合等)以产生多功能的结合分子。在基于支架的不同方法中，
胱氨酸结小蛋白(“knottin”)已显示出开发靶向诊断和治疗剂的巨大潜力。小蛋白是小的、30
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50个氨基酸的多肽，包含3个二硫键，形成同名的打结结构。假结胱氨酸拓扑结构是非凡的热、蛋白水解和化学稳定性的原因，这对于体内生物医学应用是期望的。例如，在不损失结构和功能完整性的情况下，小蛋白可以在碱性或酸性环境中煮沸。受二硫键限制的环区可耐受广泛的序列多样性，为识别各种生物医学靶标的工程蛋白提供强大的分子框架。
[0005]本领域需要可用于诊断和治疗方法的纤连蛋白额外结构域B结合分子。
[0006]本文描述了纤连蛋白额外结构域B结合剂如纤连蛋白额外结构域B结合肽，其对人纤连蛋白额外结构域B表现出高特异性和选择性。本文描述的纤连蛋白额外结构域B结合剂是诊断应用(特别是肿瘤成像)以及通过有效靶向肿瘤环境的治疗应用的优秀工具。

技术实现思路

[0007]根据本专利技术，将来自木鳖子(Momordica cochinchinensis)的knottin型胰蛋白酶抑制剂II的开链变体(oMCoTI-II)用作分子支架用于工程化纤连蛋白额外结构域B(EDB)特异性结合蛋白。为此，将基于来自木鳖子的胰蛋白酶抑制剂II(oMCoTI-II)的噬菌体文库用来选择针对重组纤连蛋白额外结构域B的胱氨酸结小蛋白。工程化的胱氨酸结小蛋白MC-FN-010和衍生物MC-FN-016的特征是高纤连蛋白额外结构域B特异性以及合理的亲和力。配体的化学寡聚化和位点定向荧光染料缀合极大地增加了结合强度，同时保留其高特异性并允许在基于U-87MG的异种移植胶质母细胞瘤小鼠模型中体内成像。两种纤连蛋白额外结构域B结合分子均在肿瘤中表现出强积累且背景信号低，除肾以外。我们的结果证实胱氨酸结小蛋白作为肿瘤成像技术的分子支架的巨大潜力。
[0008]本专利技术总体提供可用于表达纤连蛋白额外结构域B的疾病(如癌症)的治疗和/或诊断的化合物。这些化合物提供表达纤连蛋白额外结构域B的细胞的选择性检测和/或表达纤连蛋白额外结构域B的细胞和/或与其中表达纤连蛋白额外结构域B的环境相关的细胞的根除，如与表达纤连蛋白额外结构域B的细胞相关的细胞。本专利技术允许最小化对不表达纤连蛋白额外结构域B和/或与其中表达纤连蛋白额外结构域B的环境无关的正常细胞的不利影响。
[0009]本专利技术提供纤连蛋白额外结构域B(EDB)结合肽，其包含氨基酸序列基序Arg-Ile/Val-Arg。
[0010]在一实施方案中，纤连蛋白额外结构域B(EDB)结合肽包含氨基酸序列基序Arg-Ile/Val-Arg-Leu。
[0011]在一实施方案中，纤连蛋白额外结构域B结合肽包含氨基酸序列：
[0012](Xaa)n1 Cys(Xaa)n2 Arg Ile/Val Arg(Xaa)n3 Cys(Xaa)n4 Cys(Xaa)n5 Cys(Xaa)n6 Cys(Xaa)n7 Cys(Xaa)n8
[0013]其中
[0014]Cys残基形成胱氨酸结结构，
[0015]Xaa彼此独立地是任何氨基酸，并且
[0016]n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7和n8是各自的氨基酸数目，
[0017]其中氨基酸Xaa的性质和/或氨基酸的数目n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7和n8使得Cys残基之间能够形成胱氨酸结结构。
[0018]在纤连蛋白额外结构域B结合肽的一实施方案中：
[0019]n1是0-4，优选1或2，
[0020]n2是3-10，优选4、5、6或7，
[0021]n3是0-4，优选0或1，
[0022]n4是3-7，优选4、5或6，
[0023]n5是2-6，优选2、3或4，
[0024]n6是1-3，优选1或2，
[0025]n7是3-7，优选4、5或6，并且...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种纤连蛋白额外结构域B(EDB)结合肽，其包含氨基酸序列基序Arg-Ile/Val-Arg。2.权利要求1的EDB结合肽，其包含氨基酸序列基序Arg-Ile/Val-Arg-Leu。3.权利要求1或2的EDB结合肽，其包含氨基酸序列：(Xaa)n1 Cys(Xaa)n2 Arg Ile/Val Arg(Xaa)n3 Cys(Xaa)n4 Cys(Xaa)n5 Cys(Xaa)n6Cys(Xaa)n7 Cys(Xaa)n8其中Cys残基形成胱氨酸结结构，Xaa彼此独立地是任何氨基酸，并且n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7和n8是各自的氨基酸数目，其中氨基酸Xaa的性质和/或氨基酸的数目n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7和n8使得Cys残基之间能够形成胱氨酸结结构。4.权利要求1-3中任一项的EDB结合肽，其中n1是0-4，优选1或2，n2是3-10，优选4、5、6或7，n3是0-4，优选0或1，n4是3-7，优选4、5或6，n5是2-6，优选2、3或4，n6是1-3，优选1或2，n7是3-7，优选4、5或6，并且n8是0-4，优选1或2。5.权利要求3或4的EDB结合肽，其中(Xaa)n3是Leu或缺失，优选其中(Xaa)n3是Leu。6.权利要求3-5中任一项的EDB结合肽，其中(Xaa)n2是(Xaa)n2
’
Asn，其中优选n2
’
是2-9，优选3、4、5或6。7.权利要求3-6中任一项的EDB结合肽，其中(Xaa)n7是Arg(Xaa)n7
’
，其中优选n7
’
是2-6，优选3、4或5。8.权利要求3-7中任一项的EDB结合肽，其中n2是5或6或者n2
’
是4或5，n3是0或1，n4是5，n5是3，n6是1，并且n7是5或n7
’
是4。9.权利要求3-8中任一项的EDB结合肽，其包含氨基酸序列：(Xaa)n1 Cys(Xaa)n2 Arg Ile/Val Arg(Xaa)n3 Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys(Xaa)n5Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys(Xaa)n8。10.权利要求3-9中任一项的EDB结合肽，其包含氨基酸序列：(Xaa)n1 Cys(Xaa)n2 Arg Ile/Val Arg(Xaa)n3 Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys(Xaa)n5Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys Gly。11.权利要求1-10中任一项的EDB结合肽，其中Ile/Val是Ile。
12.权利要求1-10中任一项的EDB结合肽，其中Ile/Val是Val。13.权利要求1-12中任一项的EDB结合肽，其包含选自以下的氨基酸序列：(i)TrpLysCysGlnProThrAsnGlyTyrArgIleArgCysArgArgAspSerAspCysProGlyAspCysIleCysArgGlyAsnGlyTyrCysGly，(ii)SerValCysLysAsnValSerIleMetArgIleArgLeuCysArgArgAspSerAspCysProGlyAlaCysIleCysArgGlyAsnGlyTyrCysGly，(iii)SerValCysAlaHisTyrAsnThrIleArgValArgLeuCysArgArgAspSerAspCysProGlyAlaCysIleCysArgGlyAsnGlyTyrCysGly，(iv)ProMetCysThrGlnArgLysAsnArgIleArgLeuCysArgArgAspSerAspCysThrGlyAlaCysIleCysArgGlyAsnGlyTyrCysGly，(v)SerValCysLysGlnAlaAsnPheValArgIleArgLeuCysArgArgAspSerAspCysProGlyAlaCysIleCysArgGlyAsnGlyTyrCysGly，(vi)AlaMetCysThrGlnArgLysAsnArgIleArgLeuCysArgArgAspSerAspCysThrGlyAlaCysIleCysArgGlyAsnGlyTyrCysGly，(vii)ProAlaCysThrGlnArgLysAsnArgIleArgLeuCysArgArgAspSerAspCysThrGlyAlaCysIleCysArgGlyAsnGlyTyrCysGly，(viii)ProMetCysAlaGlnArgLysAsnArgIleArgLeuCysArgArgAspSerAspCysThrGlyAlaCysIleCysArgGlyAsnGlyTyrCysGly，(ix)ProMetCysThrAlaArgLysAsnArgIleArgLeuCysArgArgAspSerAspCysThrGlyAlaCysIleCysArgGlyAsnGlyTyrCysGly，(x)ProMetCysThrGlnAlaLysAsnArgIleArgLeuCysArgArgAspSerAspCysThrGlyAlaCysIleCysArgGlyAsnGlyTyrCysGly，(xi)ProMetCysThrGlnArgAlaAsnArgIleArgLeuCysArgArgAspSerAspCysThrGlyAlaCysIleCysArgGlyAsnGlyTyrCysGly，(xii)ProMetCysThrGlnArgLysAlaArgIleArgLeuCysArgArgAspSerAspCysThrGlyAlaCysIleCysArgGlyAsnGlyTyrCysGly，(xiii)ProMetCysThrGlnArgLysAsnArgIleArgLeuCysAlaArgAspSerAspCysThrGlyAlaCysIleCysArgGlyAsnGlyTyrCysGly，以及(xiv)ProMetCysThrGlnArgLysAsnArgIleArgLeuCysArgAl...

【专利技术属性】
技术研发人员：U，
申请(专利权)人：生物技术欧洲股份公司，
类型：发明
国别省市：