基因组编辑的方法和组合物技术

所提供的是使用含有多个有效负载的递送媒介物进行基因组编辑的方法和组合物。在一些实施例中，递送媒介物包含有效负载，该有效负载包含(a)剪切细胞的基因组的一种或多种序列特异性核酸酶或编码它们的一种或多种核酸，(b)第一供体DNA，其包含被插入细胞的基因组中的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列的插入在细胞的基因组中的插入位点产生位点特异性重组酶的靶序列(例如，attP位点)；(c)位点特异性重组酶(或编码它的核酸)(例如，ΦC31，ΦC31RDF，Cre，FLP)，其中位点特异性重组酶识别所述靶序列；和(d)第二供体DNA，其包含核苷酸序列，由于位点特异性重组酶对所述靶序列的识别，该核苷酸序列被插入细胞的基因组中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因组编辑的方法和组合物相关申请交叉引用本申请要求于2018年4月24日提交的美国临时专利申请号62/661,992，以及于2018年6月14日提交的美国临时专利申请号62/685,240的权益，两个申请均通过引用整体并入本文。
在大多数情况下，基因组编辑仍然是效率低的过程。虽然存在执行位点特异性基因编辑的许多技术，但由于递送技术不足，临床转译受到阻碍-特别是考虑到体内递送时。照此，有效率的基因组编辑的组合物和方法仍然是重要的未满足的需求。
技术介绍
所提供的是使用含有多个有效负载的递送媒介物进行基因组编辑的组合物和方法。在一些实施例中，主题方法包括将递送媒介物引入细胞中，其中递送媒介物包含有效负载，该有效负载包含(a)剪切(cleaving)细胞的基因组的一种或多种序列特异性核酸酶(例如，大范围核酸酶，归巢核酸内切酶，锌指核酸酶(ZFN)，TALEN，I型或III型CRISPR/Cas剪切复合物，2类CRISPR/Cas效应蛋白-RNA-向导的CRISPR/Cas多肽-如Cas9，CasX，CasY，Cpf1(Cas12a)，Cas13，MAD7等)或编码一种或多种序列特异性核酸酶的一种或多种核酸[(a)在本文中称为核酸酶组合物]；(b)第一供体DNA，其包含被插入细胞的基因组中的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列的插入在细胞的基因组中的插入位点产生位点特异性重组酶的靶序列(例如，attP位点)[(b)在本文中称为靶供体组合物]；(c)位点特异性重组酶(或编码它的核酸)(例如，ΦC31，ΦC31RDF，Cre，FLP)，其中位点特异性重组酶识别所述靶序列[(c)在本文中称为重组酶组合物]；和(d)第二供体DNA，其包含核苷酸序列，该核苷酸序列因位点特异性重组酶对所述靶序列的识别而被插入细胞的基因组中[(d)在本文中称为插入物供体组合物]。通过一个或多个位点特异性重组酶的靶位点的插入，然后通过重组酶介导的感兴趣的核苷酸序列的插入，包含(a)，(b)，(c)，和(d)的递送媒介物有助于大的序列插入基因组中。在一些情况下，被插入的感兴趣的核苷酸序列(来自插入物供体组合物)为10千个碱基对(kbp)或更多(例如，15kbp至100kbp，30kbp至100kbp，或50kbp至100kbp)。在一些情况下，第一供体DNA的核苷酸序列的插入在细胞的基因组中的第一位置产生位点特异性重组酶的第一靶序列，并且在细胞的基因组中的第二位置产生位点特异性重组酶的第二靶序列(例如，两个attP位点的插入)。在一些情况下，核酸酶组合物在两个位置剪切细胞的基因组，并且靶供体组合物包含两个第一供体DNA，每个均包含被插入细胞的基因组中的核苷酸序列，从而在细胞的基因组中的第一位置产生位点特异性重组酶的第一靶序列，并且在细胞的基因组中的第二位置产生位点特异性重组酶的第二靶序列(两个attP位点的插入)。在一些情况下，第二供体DNA包含位点特异性重组酶的两个靶序列(例如，attB位点)，其中，两个靶序列位于被插入细胞的基因组中的核苷酸序列的侧翼。递送媒介物可在体外，离体(exvivo)，或在体内被引入细胞中/递送至细胞。将多个有效负载作为同一递送媒介物(例如，纳米颗粒)的一部分进行递送的一个优点是每个有效负载的效率未被稀释。作为说明性示例，如果有效负载A和有效负载B在两个分别的(separate)包装(packages)/媒介物(分别为包装A和包装B)中被递送，则效率是相乘的，例如，如果包装A和包装B各自具有1％的转染效率，则将有效负载A和有效负载B递送至同一细胞的机会为0.01％(1％X1％)。但是，如果有效负载A和有效负载B都作为同一递送媒介物的一部分被递送，则将有效负载A和有效负载B递送至同一细胞的机会为1％，比0.01％提高了100倍。递送媒介物可以包括但不限于，非病毒媒介物，病毒媒介物，纳米颗粒(例如，包括靶向配体和/或核的纳米颗粒，该核包含阴离子聚合物组合物，阳离子聚合物组合物，和阳离子多肽组合物)，脂质体，胶束，水-油-水乳液颗粒，油-水-乳液胶束颗粒，多层水-油-水乳液颗粒，与带电荷的聚合物多肽结构域缀合的靶向配体(例如，肽靶向配体)(其中，靶向配体提供与细胞表面蛋白的靶向结合，并且带电荷的聚合物多肽结构域与核酸有效负载聚集(condensed)和/或与蛋白有效负载静电地相互作用)，与有效负载缀合的靶向配体(例如，肽靶向配体)(其中，靶向配体提供与细胞表面蛋白的靶向结合)等。在一些情况下，有效负载作为一种或多种脱氧核糖核蛋白复合物和/或一种或多种核糖-脱氧核糖核蛋白复合物被引入细胞中。所提供的组合物和方法可被用于在任何细胞类型(例如，工程T细胞，例如，在体内)中的任何基因座处进行基因组编辑。例如，可以对CD8+T细胞群体或CD8+和CD4+T细胞的混合物进行编程，以瞬时地或永久地表达CDR1，CDR2，和/或CDR3结构域的合适TCRα/TCRβ对，以进行抗原识别。附图简要说明当结合附图阅读时，通过以下详细描述可以最好地理解本专利技术。要强调的是，根据惯例，附图的多个特征未按比例绘制。相反，为了清楚起见，多个特征的尺寸被任意扩大或缩小。附图中包括以下图。图1描绘了主题方法的一个示例的示意图。在该特定示例中：在用序列特异性核酸酶剪切基因组后，将两个靶序列(例如，attP位点)插入基因组中(使用靶供体组合物的供体DNA)；插入物供体组合物的供体DNA上存在两个靶序列(例如，attB位点)；在使用位点特异性重组酶(例如，PhiC31(ΦC31))将来自(插入物供体组合物的)供体DNA的序列插入后，基因组中仍然存在两个残余(residual)位点(例如，attR位点)。图2描绘了递送媒介物的示例实施例的示意图(在所示的情况下，是一种类型的纳米颗粒)。图3描绘了递送媒介物的示例实施例的示意图(在所示的情况下，是一种类型的纳米颗粒)。在该情况下，所示的纳米颗粒是多层的，该纳米颗粒具有核(包括第一有效负载)，该核被第一可脱落层包围，该第一可脱落层被中间层(包括额外的有效负载)包围，该中间层被第二可脱落层包围，该第二可脱落层的表面被包覆(即，包括外壳)。图4(小图A-B)描绘了主题纳米颗粒的表面涂层的靶向配体的示例构型的示意图。所示的递送分子包括与锚定结构域缀合的靶向配体，该锚定结构域与纳米颗粒的可脱落层静电地相互作用。应注意，靶向配体可以在N-或C-末端缀合(每个小图的左侧)，但是也可以在内部位置缀合(每个小图的右侧)。小图A中的分子包括接头，小图B中的分子不包括接头。图5A提供了供体媒介物的示例实施例的示意图(在所示的情况下，是主题递送分子的示例构型)。靶向配体可以在N-或C-末端缀合(图的左侧)，但是也可以在内部位置缀合(图的右侧)。该图示出了递送分子，其包括接头以及与有效负载缀合的靶向配体。图5B提供了供体媒介物的示例实施例的示意图(在所示的情况下，是主题递送分子的示例构型)。靶向配体可以在N-或C-末端缀合(图的左侧)，但是也可以在内部位置缀合(图的右侧)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种将供体序列插入细胞的基因组中的方法，包括：/n将具有有效负载的递送媒介物引入细胞，该有效负载包含：/n(a)核酸酶组合物，其包含：一种或多种序列特异性核酸酶或编码所述一种或多种序列特异性核酸酶的一种或多种核酸，其中所述一种或多种序列特异性核酸酶剪切所述细胞的基因组；/n(b)靶供体组合物，其包含：第一供体DNA，其包含被插入所述细胞的基因组中的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列的插入在所述细胞的基因组中的插入位点产生位点特异性重组酶的靶序列；/n(c)重组酶组合物，其包含：所述位点特异性重组酶，或编码所述位点特异性重组酶的核酸，其中所述位点特异性重组酶识别所述靶序列；和/n(d)插入物供体组合物，其包含：第二供体DNA，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列因所述细胞特异性重组酶对所述靶序列的识别而被插入所述细胞的基因组中。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180424 US 62/661,992;20180614 US 62/685,2401.一种将供体序列插入细胞的基因组中的方法，包括：
将具有有效负载的递送媒介物引入细胞，该有效负载包含：
(a)核酸酶组合物，其包含：一种或多种序列特异性核酸酶或编码所述一种或多种序列特异性核酸酶的一种或多种核酸，其中所述一种或多种序列特异性核酸酶剪切所述细胞的基因组；
(b)靶供体组合物，其包含：第一供体DNA，其包含被插入所述细胞的基因组中的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列的插入在所述细胞的基因组中的插入位点产生位点特异性重组酶的靶序列；
(c)重组酶组合物，其包含：所述位点特异性重组酶，或编码所述位点特异性重组酶的核酸，其中所述位点特异性重组酶识别所述靶序列；和
(d)插入物供体组合物，其包含：第二供体DNA，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列因所述细胞特异性重组酶对所述靶序列的识别而被插入所述细胞的基因组中。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述靶供体组合物的所述第一供体DNA的所述核苷酸序列的插入在所述细胞的基因组中的第一位置产生所述位点特异性重组酶的第一靶序列，并且在所述细胞的基因组中的第二位置产生所述位点特异性重组酶的第二靶序列。


3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核酸酶组合物在两个位置剪切所述细胞的基因组，并且其中所述靶供体组合物包含所述第一供体DNA的两个，每个均包含被插入所述细胞的基因组中的核苷酸序列，从而在所述细胞的基因组中的第一位置产生所述位点特异性重组酶的第一靶序列，并且在所述细胞的基因组中的第二位置产生所述位点特异性重组酶的第二靶序列。


4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中，所述细胞的基因组中的所述第一和第二位置相隔1,000,000个碱基对或更少。


5.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中，所述细胞的基因组中的所述第一和第二位置相隔100,000个碱基对或更少。


6.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中，被插入所述细胞的基因组中的所述插入物供体组合物的所述核苷酸序列的长度为10个碱基对(bp)至100千个碱基对(kbp)。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述第二供体DNA包含位点特异性重组酶的两个靶序列，其中所述两个靶序列位于被插入所述细胞的基因组中的所述核苷酸序列的侧翼。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述位点特异性重组酶的所述靶序列选自：attB位点，attP位点，attL位点，attR位点，loxP位点，和FRT位点。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述位点特异性重组酶选自：ΦC31，ΦC31RDF，Cre，和FLP。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种序列特异性核酸酶中的至少一种选自：大范围核酸酶，归巢核酸内切酶，锌指核酸酶(ZFN)，和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。


11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种序列特异性核酸酶中的至少一种是2类CRISPR/Cas效应蛋白。


12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述2类CRISPR/Cas效应蛋白选自Cas9和cpf1。


13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中，所述核酸酶组合物包含一种或多种CRISPR/Cas向导核酸或编码所述CRISPR/Cas向导核酸的一种或多种核酸。


14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述递送媒介物是非病毒的。


15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述递送媒介物是纳米颗粒。


16.根据权利要求15所述的方法，其中，除了所述有效负载之外，所述纳米颗粒还包含核，所述核包含阴离子聚合物组合物，阳离子聚合物组合物，和阳离子多肽组合物。


17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述阴离子聚合物组合物包含选自聚(谷氨酸)和聚(天冬氨酸)的阴离子聚合物。


18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中，所述阳离子聚合物组合物包含选自聚(精氨酸)，聚(赖氨酸)，聚(组氨酸)，聚(鸟氨酸)，和聚(瓜氨酸)的阳离子聚合物。


19.根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其中，所述纳米颗粒还包含包裹所述核的可脱落层。


20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述可脱落层是阴离子涂层或阳离子涂层。


21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中，所述可脱落层包含以下一种或多种：二氧化硅，类肽，聚半胱氨酸，钙，氧化钙，羟基磷灰石，磷酸钙，硫酸钙，锰，氧化锰，磷酸锰，硫酸锰，镁，氧化镁，磷酸镁，硫酸镁，铁，氧化铁，磷酸铁，和硫酸铁。


22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中，所述纳米颗粒还包含包围所述可脱落层的表面涂层。


23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述表面涂层包含与所述可脱落层静电地相互作用的阳离子或阴离子锚定结构域。


24.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中，所述表面涂层包含一种或多种靶向配体。


25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述一种或多种靶向配体选自：肽，ScFv，F(ab)，核酸适体，或类肽。


26.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中，所述表面涂层包含一种或多种靶向配体，所述靶向配体选自：狂犬病病毒糖蛋白(RVG)片段，ApoE-转铁蛋白，乳铁蛋白，黑素铁蛋白，卵转铁蛋白，L-选择素，E-选择素，P-选择素，唾液酸化肽，聚唾液酸化O-连接肽，TPO，EPO，PSGL-1，ESL-1，CD44，死亡受体-3(DR3)，LAMP1，LAMP2，Mac2-BP，干细胞因子(SCF)，CD70，含SH2结构域的蛋白1A(SH2D1A)，毒蜥外泌肽-4，GLP1，RGD，转铁蛋白配体，FGF片段，琥珀酸，二膦酸盐，造血干细胞趋化脂质，鞘氨醇，神经酰胺，鞘氨醇-1-磷酸盐，神经酰胺-1-磷酸盐，IL2，CD80，CD86，CD8ε，肽-HLA-A*2402，和任何上述靶向配体的活性靶向片段。


27.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中，所述表面涂层包含提供与靶的靶向结合的一种或多种靶向配体，所述靶选自：CD3，CD8，CD4，CD28，CD90，CD45f，CD34，CD80，CD86，CD19，CD20，CD22，CD47，CD3-ε，CD3-γ，CD3-δ；TCRα，TCRβ，TCRγ，和/或TCRδ恒定区；4-1BB，OX40，OX40L，CD62L，ARP5，CCR5，CCR7，CCR10，CXCR3，CXCR4，CD94/NKG2，NKG2A，NKG2B，NKG2C，NKG2E，NKG2H，NKG2D，NKG2F，NKp44，NKp46，NKp30，DNAM，XCR1，XCL1，XCL2，ILT，LIR，Ly49，IL2R，IL7R，IL10R，IL12R，IL15R，IL18R，TNFα，IFNγ，TGF-β，和α5β1。


28.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中，所述表面涂层包含提供与靶细胞的靶向结合的一种或多种靶向配体，所述靶细胞选自：骨髓细胞，造血干细胞(HSC)，造血干细胞和祖细胞(HSPC)，外周血单核细胞(PBMC)，髓系祖细胞，淋巴样祖细胞，T细胞，B细胞，NKT细胞，NK细胞，树突细胞，单核细胞，粒细胞，红细胞，巨核细胞，肥大细胞，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜中性粒细胞，巨噬细胞，红系祖细胞，巨核细胞-红系祖细胞(MEP)，共同髓系祖细胞(CMP)，多能祖细胞(MPP)，造血干细胞(HSC)，短期HSC(ST-HSC)，IT-HSC，长期HSC(LT-HSC)，内皮细胞，神经元，星形胶质细胞，胰腺细胞，胰岛β细胞，肝脏细胞，肌细胞，骨骼肌细胞，心肌细胞，肝细胞，脂肪细胞，肠细胞，结肠细胞，和胃细胞。


29.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述递送媒介物是与所述有效负载缀合的靶向配体，其中，所述靶向配体提供与细胞表面蛋白的靶向结合。


30.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述递送媒介物是与带电荷的聚合物多肽结构域缀合的靶向配体，其中，所述靶向配体提供与细胞表面蛋白的靶向结合，并且其中，所述带电荷的聚合物多肽结构域与核酸有效负载缩合和/或与蛋白有效负载静电地相互作用。


31.根据权利要求29或30所述的方法，其中，所述靶向配体是肽，ScFv，F(ab)，核酸适体，或类肽。


32.根据权利要求30所述的方法，其中，所述带电荷的聚合物多肽结构域具有范围为3至30个氨基酸的长度。


33.根据权利要求30-32中任一项所述的方法，其中，所述递送媒介物还包含与所述有效负载和所述带电荷的聚合物多肽结构域相互作用的阴离子聚合物。


34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述阴离子聚合物选自聚(谷氨酸)和聚(天冬氨酸)。


35.根据权利要求29-34中任一项所述的方法，其中，所述靶向配体具有5-50个氨基酸的长度。


36.根据权利要求29-35中任一项所述的方法，其中，所述靶向配体提供与细胞表面蛋白的靶向结合，所述细胞表面蛋白选自：B族G蛋白偶联受体(GPCR)，受体酪氨酸激酶(RTK)，细胞表面糖蛋白，和细胞-细胞粘附分子。


37.根据权利要求29-35中任一项所述的方法，其中，所述靶向配体选自：狂犬病病毒糖蛋白(RVG)片段，ApoE-转铁蛋白，乳铁蛋白，黑素铁蛋白，卵转铁蛋白，L-选择素，E-选择素，P-选择素，唾液酸化肽，聚唾液酸化O-连接肽，TPO，EPO，PSGL-1，ESL-1，CD44，死亡受体-3(DR3)，LAMP1，LAMP2，Mac2-BP，干细胞因子(SCF)，CD70，含SH2结构域的蛋白1A(SH2D1A)，毒蜥外泌肽，毒蜥外泌肽-S11C，GLP1，RGD，转铁蛋白配体，FGF片段，α5β1配体，IL2，Cde3-ε，肽-HLA-A*2402，CD80，CD86，琥珀酸，二膦酸盐，造血干细胞趋化脂质，鞘氨醇，神经酰胺，鞘氨醇-1-磷酸盐，神经酰胺-1-磷酸盐，和任何上述靶向配体的活性靶向片段。


38.根据权利要求29-35中任一项所述的方法，其中，所述靶向配体提供与靶的靶向结合，所述靶选自：CD3，CD28，CD90，CD45f，CD34，CD80，CD86，CD19，CD20，CD22，CD47，CD3-ε，CD3-γ，CD3-δ；TCRα，TCRβ，TCRγ，和/或TCRδ恒定区；4-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德烈·罗纳德·沃森，克里斯蒂安·福斯特，林帅亮，
申请(专利权)人：利甘达尔股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US