基因组编辑的方法和组合物技术

所提供的是使用粘性端进行基因组编辑的方法和组合物。主题方法包括：(a)在靶细胞的基因组DNA中的两个位置的每一个均产生交错的切割，从而产生两个基因组的交错端；(b)提供/引入线性双链供体DNA，其具有与基因组DNA的粘性端匹配/对应的交错端(即，粘性端)，使得供体DNA的粘性端与基因组DNA的粘性端杂交，并将供体DNA插入基因组。在一些情况下，通过将一种或多种序列特异性核酸酶(或编码一种或多种序列特异性核酸酶的一种或多种核酸)引入靶细胞以产生交错的切割。产生交错的切割。产生交错的切割。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因组编辑的方法和组合物
[0001]相关申请交叉引用
[0002]本申请要求于2018年4月18日提交的美国临时专利申请号62/659,627，于2018年6月14日提交的美国临时专利申请号62/685,243，以及于2018年9月25日提交的美国临时专利申请号62/736,400的权益，所有申请均通过引用整体并入本文。


[0003]在大多数情况下，基因组编辑仍然是效率低的过程。有效率的基因组编辑的组合物和方法仍然是重要的未满足的需求。

技术介绍

[0004]所提供的是使用粘性端进行基因组编辑的组合物和方法。在一些实施例中，主题方法包括：(a)在靶细胞的基因组DNA中的两个位置的每一个均产生交错的切割，从而产生两个粘性端(基因组的交错端)；和(b)提供/引入线性双链供体DNA，其具有与基因组DNA的粘性端相对应的交错端(即，粘性端)，使得供体DNA的粘性端与基因组DNA的粘性端杂交，并将供体DNA插入基因组。该方法在本文中通常也称为“俄罗斯方块(tetris)”或“俄罗斯方块介导的”。在一些情况下，通过将一种或多种序列特异性核酸酶(或编码一种或多种序列特异性核酸酶的一种或多种核酸)引入靶细胞以产生交错的切割，例如，大范围核酸酶，归巢核酸内切酶，锌指核酸酶(ZFN)，TALEN，2类CRISPR/Cas效应蛋白(RNA
‑
向导的CRISPR/Cas多肽)(如Cas9，CasX，CasY，Cpf1(Cas12a)，Cas13，MAD7等)。
[0005]在一些情况下，供体DNA和一种或多种序列特异性核酸酶(或编码一种或多种序列特异性核酸酶的一种或多种核酸)是同一递送媒介物(其可被引入细胞/递送至细胞，例如，在体外，离体(ex vivo)，或在体内)的有效负载。将多种有效负载作为同一递送媒介物(例如，纳米颗粒)的一部分进行递送的一个优点是每种有效负载的效率未被稀释。作为说明性示例，如果有效负载A和有效负载B在两个分开的包装(packages)/媒介物(分别为包装A和包装B)中被递送，则效率是相乘的，例如，如果包装A和包装B各自具有1％的转染效率，则将有效负载A和有效负载B递送至同一细胞的机会为0.01％(1％X1％)。但是，如果有效负载A和有效负载B都作为同一递送媒介物的一部分被递送，则将有效负载A和有效负载B递送至同一细胞的机会为1％，比0.01％提高了100倍。
[0006]在一些实施例中，当被递送时(例如，作为同一递送媒介物的一部分)，供体DNA(例如，供体DNA的端)与一种或多种序列特异性核酸酶(例如，一个或多个核酸酶对)结合，例如，供体DNA可以与一种或多种核酸酶“预装配”。供体DNA与核酸酶的共递送可导致在与基因组切割位点结合期间发生热力学“转换”，从而使核酸酶(例如，一个或多个核酸酶对)从供体DNA转移至基因组上，然后供体DNA插入(slot into)基因组。主题组合物和方法提供了一种不使用同源定向修复(HDR)，而是通过匹配“粘性端”来对插入进行介导，以将供体DNA插入DNA靶的方法。
[0007]递送媒介物可以包括但不限于，非病毒媒介物，病毒媒介物，纳米颗粒(例如，包括
靶向配体和/或核的纳米颗粒，该核包含阴离子聚合物组合物，阳离子聚合物组合物，和阳离子多肽组合物)，脂质体，胶束，水
‑
油
‑
水乳液颗粒，油
‑
水
‑
乳液胶束颗粒，多层水
‑
油
‑
水乳液颗粒，与带电荷的聚合物多肽结构域缀合的靶向配体(例如，肽靶向配体)(其中，靶向配体提供与细胞表面蛋白的靶向结合，并且带电荷的聚合物多肽结构域与核酸有效负载聚集(condensed)和/或与蛋白有效负载静电地相互作用)，与有效负载缀合的靶向配体(例如，肽靶向配体)(其中，靶向配体提供与细胞表面蛋白的靶向结合)等。在一些情况下，有效负载作为脱氧核糖核蛋白复合物或核糖
‑
脱氧核糖核蛋白复合物引入细胞。
[0008]所提供的组合物和方法可被用于在任何细胞类型(例如，工程T细胞，例如，在体内)中的任何基因座处进行基因组编辑。例如，可以对CD8+ T细胞群体或CD8+和CD4+ T细胞的混合物进行编程，以瞬时地或永久地表达CDR1，CDR2，和/或CDR3结构域的合适TCR α/TCR β对，以进行抗原识别。
[0009]附图简要说明
[0010]当结合附图阅读时，通过以下详细描述可以最好地理解本专利技术。要强调的是，根据惯例，附图的多个特征未按比例绘制。相反，为了清楚起见，多个特征的尺寸被任意扩大或缩小。附图中包括以下图。
[0011]图1描述了具有粘性端的主题线性双链供体DNA的示例实施例的示意图。在一个所示的情况下，两端均具有5
’
突出端，而在另一个所示的情况下，两端均具有3
’
突出端。
[0012]图2描述了主题方法的一个示例的示意图。
[0013]图3描述了递送包装的示例实施例的示意图(在所示的情况下，一种类型是纳米颗粒)。
[0014]图4描述了递送包装的示例实施例的示意图(在所示的情况下，一种类型是纳米颗粒)。在这种情况下，所示的纳米颗粒是多层的，该纳米颗粒具有核(包括第一有效负载)，该核被第一可脱落层包围，该第一可脱落层被中间层(包括附加的有效负载)包围，该中间层被第二可脱落层包围，该第二可脱落层的表面被包覆(即，包括外壳)。
[0015]图5(小图A
‑
B)描述了主题纳米颗粒的表面涂层的靶向配体的示例构型的示意图。所示的递送分子包括与锚定结构域缀合的靶向配体，该锚定结构域与纳米颗粒的可脱落层静电地相互作用。应注意，靶向配体可以在N
‑
或C
‑
末端(每个小图的左侧)缀合，但是也可以在内部位置(每个小图的右侧)缀合。小图A中的分子包括接头，而小图B中的分子不包括接头。
[0016]图6(小图A
‑
D)提供了递送包装的示例实施例的示意图(在所示的情况下，主题递送分子的示例构型)。应注意，靶向配体可以在N
‑
或C
‑
末端(每个小图的左侧)缀合，但是也可以在内部位置(每个小图的右侧)缀合。小图A和C中的分子包括接头，而小图B和D中的分子不包括接头。(小图A
‑
B)递送分子，其包括与有效负载缀合的靶向配体。(小图C
‑
D)递送分子，其包括与带电荷的聚合物多肽结构域缀合的靶向配体，该带电荷的聚合物多肽结构域与核酸有效负载聚集(和/或相互作用，例如，静电地与蛋白有效负载)。
[0017]图7提供了可被使用的细胞核定位信号(NLS)的非限制性示例(例如，作为纳米颗粒的一部分，例如，作为含NLS的肽；作为含NLS的肽的一部分/缀合至含NLS的肽，阴离子聚合物，阳离子聚合物，和/或阳离子多肽等)。该图改编自Kosugi等，《生物化学杂志(J Biol Che本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在靶细胞中进行基因组编辑的方法，包括：(a)在所述靶细胞的基因组内的两个位置产生具有交错端的双链切割，从而产生第一基因组的交错端和第二基因组的交错端；和(b)将在每端均具有5
’
或3
’
突出端的线性双链供体DNA引入所述靶细胞，其中，所述供体DNA的一端与所述第一基因组的交错端杂交，并且所述供体DNA的另一端与所述第二基因组的交错端杂交，从而导致所述线性双链供体DNA插入所述靶细胞的基因组。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述供体DNA的至少一端具有5
’
突出端，并且所述基因组的交错端的至少一个具有5
’
突出端。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述供体DNA的至少一端具有3
’
突出端，并且所述基因组的交错端的至少一个具有3
’
突出端。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中，所述产生包括将一种或多种序列特异性核酸酶，或编码所述一种或多种序列特异性核酸酶的一种或多种核酸引入所述靶细胞以产生所述双链切割。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述一种或多种序列特异性核酸酶包含以下至少一种：大范围核酸酶，归巢核酸内切酶，锌指核酸酶(ZFN)，和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述一种或多种序列特异性核酸酶包含交错端切割CRISPR/Gas效应蛋白。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述产生进一步包括将CRISPR/Gas向导核酸，或编码所述CRISPR/Gas向导核酸的核酸引入所述细胞。8.根据权利要求4
‑
7中任一项所述的方法，其中，所述方法包括将以下作为同一递送媒介物的有效负载引入所述细胞：(i)所述一种或多种序列特异性核酸酶，或编码所述一种或多种序列特异性核酸酶的一种或多种核酸，和(ii)所述线性双链供体DNA。9.根据权利要求8所述的方法，其中，将所述一种或多种序列特异性核酸酶和所述线性双链供体DNA作为脱氧核糖核蛋白复合物或核糖
‑
脱氧核糖核蛋白复合物引入所述细胞。10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中，在所述引入期间，所述供体DNA的所述端以位点特异性方式结合至所述一种或多种序列特异性核酸酶。11.根据权利要求8
‑
10中任一项所述的方法，其中，所述递送媒介物是非病毒的。12.根据权利要求8
‑
11中任一项所述的方法，其中，所述递送媒介物是纳米颗粒。13.根据权利要求12所述的方法，其中，除了(i)和(ii)之外，所述纳米颗粒还包含核，所述核包含阴离子聚合物组合物，阳离子聚合物组合物，和阳离子多肽组合物。14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述阴离子聚合物组合物包含选自聚(谷氨酸)和聚(天冬氨酸)的阴离子聚合物。15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中，所述阳离子聚合物组合物包含选自聚(精氨酸)，聚(赖氨酸)，聚(组氨酸)，聚(鸟氨酸)，和聚(瓜氨酸)的阳离子聚合物。16.根据权利要求13
‑
15中任一项所述的方法，其中，纳米颗粒进一步包含包裹所述核的可脱落层。17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述可脱落层是阴离子涂层或阳离子涂层。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中，所述可脱落层包含以下一种或多种：二氧化硅，类肽，聚半胱氨酸，钙，氧化钙，羟基磷灰石，磷酸钙，硫酸钙，锰，氧化锰，磷酸锰，硫酸锰，镁，氧化镁，磷酸镁，硫酸镁，铁，氧化铁，磷酸铁，和硫酸铁。19.根据权利要求16
‑
18中任一项所述的方法，其中，所述纳米颗粒进一步包含包围所述可脱落层的表面涂层。20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述表面涂层包含与所述可脱落层静电地相互作用的阳离子或阴离子锚定结构域。21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中，所述表面涂层包含一种或多种靶向配体。22.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中，所述表面涂层包含一种或多种靶向配体，所述靶向配体选自：狂犬病病毒糖蛋白(RVG)片段，ApoE
‑
转铁蛋白，乳铁蛋白，黑素铁蛋白，卵转铁蛋白，L
‑
选择素，E
‑
选择素，P
‑
选择素，唾液酸化肽，聚唾液酸化O
‑
连接肽，TPO，EPO，PSGL
‑
1，ESL
‑
1，CD44，死亡受体
‑
3(DR3)，LAMP1，LAMP2，Mac2
‑
BP，干细胞因子(SCF)，CD70，含SH2结构域的蛋白1A(SH2D1A)，毒蜥外泌肽，毒蜥外泌肽
‑
S11C，GLP1，RGD，转铁蛋白配体，FGF片段，α5β1配体，IL2，Cde3
‑
ε，肽
‑
HLA
‑
A*2402，CD80，CD86，琥珀酸，二膦酸盐，造血干细胞趋化脂质，鞘氨醇，神经酰胺，鞘氨醇
‑1‑
磷酸盐，神经酰胺
‑1‑
磷酸盐，和任何上述靶向配体的活性靶向片段。23.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中，所述表面涂层包含一种或多种靶向配体，所述靶向配体提供与靶的靶向结合，所述靶选自：CD3，CD8，CD4，CD28，CD90，CD45f，CD34，CD80，CD86，CD3
‑
ε，CD3
‑
γ，CD3
‑
δ；TCRα，TCRβ，TCRγ，和/或TCRδ恒定区；4
‑
1BB，OX40，OX40L，CD62L，ARP5，CCR5，CCR7，CCR10，CXCR3，CXCR4，CD94/NKG2，NKG2A，NKG2B，NKG2C，NKG2E，NKG2H，NKG2D，NKG2F，NKp44，NKp46，NKp30，DNAM，XCR1，XCL1，XCL2，ILT，LIR，Ly49，IL2R，IL7R，IL10R，IL12R，IL15R，IL18R，TNFα，IFNγ，TGF
‑
β，和α5β1。24.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中，所述表面涂层包含一种或多种靶向配体，所述靶向配体提供与靶细胞的靶向结合，所述靶细胞选自：骨髓细胞，造血干细胞(HSC)，造血干细胞和祖细胞(HSPC)，外周血单核细胞(PBMC)，髓系祖细胞，淋巴样祖细胞，T细胞，B细胞，NKT细胞，NK细胞，树突细胞，单核细胞，粒细胞，红细胞，巨核细胞，肥大细胞，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜中性粒细胞，巨噬细胞，红系祖细胞，巨核细胞
‑
红系祖细胞(MEP)，共同髓系祖细胞(CMP)，多能祖细胞(MPP)，造血干细胞(HSC)，短期HSC(ST
‑
HSC)，IT
‑
HSC，长期HSC(LT
‑
HSC)，内皮细胞，神经元，星形胶质细胞，胰腺细胞，胰岛β细胞，肝脏细胞，肌细胞，骨骼肌细胞，心肌细胞，肝细胞，脂肪细胞，肠细胞，结肠细胞，和胃细胞。25.根据权利要求8
‑
10中任一项所述的方法，其中，所述递送媒介物是与所述有效负载缀合的靶向配体，其中，所述靶向配体提供与细胞表面蛋白的靶向结合。26.根据权利要求8
‑
10中任一项所述的方法，其中，所述递送媒介物是与带电荷的聚合物多肽结构域缀合的靶向配体，其中，所述靶向配体提供与细胞表面蛋白的靶向结合，并且其中，所述带电荷的聚合物多肽结构域与核酸有效负载聚集和/或与蛋白有效负载静电地相互作用。27.根据权利要求25或26所述的方法，其中，所述靶向配体是肽，ScFv，F(ab)，核酸适体，或类肽。
28.根据权利要求26所述的方法，其中，所述带电荷的聚合物多肽结构域具有在3至30个氨基酸的范围内的长度。29.根据权利要求26
‑
28中任一项所述的方法，其中，所述递送媒介物进一步包含与所述有效负载和所述带电荷的聚合物多肽结构域相互作用的阴离子聚合物。30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述阴离子聚合物选自聚(谷氨酸)和聚(天冬氨酸)。31.根据权利要求25
‑
30中任一项所述的方法，其中，所述靶向配体具有5
‑
50个氨基酸的长度。32.根据权利要求25
‑
31中任一项所述的方法，其中，所述靶向配体提供与细胞表面蛋白的靶向结合，所述细胞表面蛋白选自B族G蛋白偶联受体(GPCR)，受体酪氨酸激酶(RTK)，细胞表面糖蛋白，和细胞
‑
细胞粘附分子。33.根据权利要求25
‑
31中任一项所述的方法，其中，所述靶向配体选自：狂犬病病毒糖蛋白(RVG)片段，ApoE
‑
转铁蛋白，乳铁蛋白，黑素铁蛋白，卵转铁蛋白，L
‑
选择素，E
‑
选择素，P
‑
选择素，唾液酸化肽，聚唾液酸化O
‑
连接肽，TPO，EPO，PSGL
‑
1，ESL
‑
1，CD44，死亡受体
‑
3(DR3)，LAMP1，LAMP2，Mac2
‑
BP，干细胞因子(SCF)，CD70，含SH2结构域的蛋白1A(SH2D1A)，毒蜥外泌肽，毒蜥外泌肽
‑
S11C，GLP1，RGD，转铁蛋白配体，FGF片段，α5β1配体，IL2，Cde3
‑
ε，肽
‑
HLA
‑
A*2402，CD80，CD86，琥珀酸，二膦酸盐，造血干细胞趋化脂质，鞘氨醇，神经酰胺，鞘氨醇
‑1‑
磷酸盐，神经酰胺
‑1‑
磷酸盐，和任何上述靶向配体的活性靶向片段。34.根据权利要求25
‑
31中任一项所述的方法，其中，所述靶向配体提供与靶的靶向结合，所述靶选自：CD3，CD8，CD4，CD28，CD90，CD45f，CD34，CD80，CD86，CD3
‑
ε，CD3
‑
γ，CD3
‑
δ；TCRα，TCRβ，TCRγ，和/或TCRδ恒定区；4
‑
1BB，OX40，OX40L，CD62L，ARP5，CCR5，CCR7，CCR10，CXCR3，CXCR4，CD94/NKG2，NKG2A，NKG2B，NKG2C，NKG2E，NKG2H，NKG2D，NKG2F，NKp44，NKp46，NKp30，DNAM，XCR1，XCL1，XCL2，ILT，LIR，Ly49，IL2R，IL7R，IL10R，IL12R，IL15R，IL18R，TNFα，IFNγ，TGF
‑
β，和α5β1。35.根据权利要求25
‑
31中任一项所述的方法，其中，所述靶向配体提供与细胞类型的结合，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德烈，
申请(专利权)人：利甘达尔股份有限公司，
类型：发明
国别省市：