用于核酸和/或蛋白有效负载递送的组合物和方法技术

提供了用于将有效负载(例如，核酸和/或蛋白有效负载)纳米颗粒递送至细胞的方法和组合物。在一些实施方案中，主题纳米颗粒包括核和包封所述核的可脱落层，其中所述核包括(i)阴离子聚合物组合物；(ii)阳离子聚合物组合物；(iii)阳离子多肽组合物；(iv)核酸和/或蛋白有效负载；其中：(a)所述阴离子聚合物组合物包括阴离子氨基酸的D‑异构体的聚合物和阴离子氨基酸的L‑异构体的聚合物，和/或(b)所述阳离子聚合物组合物包含阳离子氨基酸的D‑异构体的聚合物和阳离子氨基酸的L‑异构体的聚合物。在一些情况下，所述阴离子和/或阳离子氨基酸的D‑异构体的聚合物相对于所述L‑异构体的聚合物以10:1至1:10范围的比率存在。

Composition and method for nucleic acid and / or protein payload delivery

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于核酸和/或蛋白有效负载递送的组合物和方法交叉引用本申请要求于2017年6月9日提交的美国临时专利申请第62/517,346号、于2017年1月6日提交的美国临时专利申请第62/443,567号、于2017年1月6日提交的美国临时专利申请第62/443,522号以及于2016年12月14日提交的美国临时专利申请第62/434,344号的权益，所述申请均通过引用整体并入本文。通过引用作为文本文件提供的序列表并入序列表在本文中作为于2017年12月14日创建并且大小为128KB的文本文件“LGDL-004_SeqList_ST25.txt”提供。文本文件的内容通过引用以全文并入本文。
技术介绍
将核酸和/或蛋白有效负载有效引入细胞，例如用于基因组编辑和/或改变基因表达，是治疗策略和研究方法的重要目标。为了有效地引入有效负载，重要的是适当地封装有效负载以保护其在进入细胞之前免于降解，允许进入细胞，引导有效负载远离溶酶体降解途径，并且引导递送至适当的亚细胞区室。此外，在进入细胞之后从包装中释放有效负载的定时可以影响有效负载的有效性。许多用于有效负载递送的基于纳米颗粒的技术提供低水平的细胞转染并且在转染时的效力有限。需要增强有效负载向细胞递送的有效性的组合物和方法。
技术实现思路
提供了用于将有效负载(例如，核酸和/或蛋白有效负载)递送至细胞(例如纳米颗粒、病毒和非病毒递送有效负载至细胞)的组合物和方法。提供了针对血清稳定性，靶向递送至特定细胞类型，通过组蛋白和核小体样支化聚合物的内源核酸包装的仿生，核内的区室特异性解包，可变定时释放动力学设计的纳米颗粒及其使用方法。在一些实施方案中，主题纳米颗粒包括核和包封所述核的可脱落层(例如，在细胞递送期间提供所述核的暂时稳定化)，其中所述核包括(i)阴离子聚合物组合物；(ii)阳离子聚合物组合物；(iii)阳离子多肽组合物；(iv)核酸和/或蛋白有效负载；其中：(a)所述阴离子聚合物组合物包括阴离子氨基酸的D-异构体的聚合物和阴离子氨基酸的L-异构体的聚合物，和/或(b)所述阳离子聚合物组合物包括阳离子氨基酸的D-异构体的聚合物和阳离子氨基酸的L-异构体的聚合物。在一些情况下，阴离子氨基酸的D-异构体的聚合物相对于阴离子氨基酸的L-异构体的聚合物以10:1至1:10范围的比率存在。在一些情况下，阳离子氨基酸的D-异构体的聚合物相对于阳离子氨基酸的L-异构体的聚合物以10:1至1:10范围的比率存在。在一些情况下，本公开的纳米颗粒包括包围可脱落层的表面涂层。表面涂层可包括靶向配体，其提供与靶细胞的表面分子的靶向结合。在一些情况下，靶向配体(用或不用接头)与锚定结构域缀合，例如，用于将靶向配体锚定到纳米颗粒的可脱落层。还提供了多层纳米颗粒，其包括作为核的一部分的第一有效负载(例如，DNA供体模板)，其中所述核被第一可脱落层包围，第一可脱落层被包括第二有效负载(例如，基因编辑工具)的中间层包围，并且中间层被第二可脱落层包围。在一些情况下，第二可脱落层涂覆有表面涂层(例如，包括靶向配体的表面涂层)。还提供了包括两种或更多种纳米颗粒的纳米颗粒制剂，其中第一纳米颗粒的有效负载包括供体DNA模板且第二纳米颗粒的有效负载包括基因编辑工具(例如，(i)CRISPR/Cas指导RNA；(ii)编码CRISPR/Cas指导RNA的DNA；(iii)编码可编程基因编辑蛋白的DNA和/或RNA；和/或(iv)可编程基因编辑蛋白)。还提供了作为同一包装的一部分共同递送多种有效负载(例如，两种或更多种有效负载)的方法。例如，提供了将核酸和/或蛋白有效负载递送至靶细胞的方法，其中该方法包括使真核靶细胞与病毒或非病毒递送载体接触，所述载体包括(a)基因编辑工具；(b)诱导靶细胞增殖和/或使靶细胞分化偏向的核酸或蛋白药剂。附图说明当结合附图阅读时，从以下详细描述中可以最好地理解本专利技术。需要强调的是，根据惯例，附图的各种特征不是按比率的。相反，为了清楚起见，各种特征的尺寸被任意扩大或缩小。附图中包括以下附图。图1描绘了测试核酸有效负载凝聚的各种参数(例如阳离子:阴离子电荷比)的荧光测定法的结果。结果显示，例如，为2的电荷比对于编码Cas9和指导RNA分子的质粒的凝聚很有效。图2描绘产生的纳米颗粒核的粒度和ζ电位分布。数据是使用MetrixZetaViewNTA仪器获得的。纳米颗粒大小(峰值)为128.8nm，ζ电位(峰值)为+10.5mV(100％)。图3描绘了稳定化纳米颗粒核(由可脱落层包封的核)的粒度和ζ电位分布。数据是使用MetrixZetaViewNTA仪器获得的。稳定化核的大小为110.6nm，ζ电位为-42.1mV(95％)。图4描绘的数据显示具有外壳(外涂层)的纳米颗粒包括RVG9R，即融合至9-Arg肽序列(作为阳离子锚定结构域)的狂犬病病毒糖蛋白(RVG)，其特征粒度为115.8nm且ζ电位为-3.1mV(100％)。最佳外涂层产生从-50mV(对于涂覆二氧化硅的核)到0和-10mV之间(添加外壳之后)的ζ电位转变。图5描绘了细胞培养实验的结果，其中使用不同的纳米颗粒来递送核酸有效负载。该图比较了包括聚(D-谷氨酸)作为核的一部分(除聚(L-精氨酸)之外)的纳米颗粒与不包含聚(D-谷氨酸)的纳米颗粒。三行代表重复。图6(图A-D)描绘了与纳米颗粒接触的神经干细胞的显微镜图像，所述纳米颗粒包括CRISPR/Cas9表达载体作为核酸有效负载。纳米颗粒的核包括用荧光团(FITC)标记的聚(L-精氨酸)(阳离子聚合物)。内体和细胞核分别用Lysotracker(红色)和Hoescht3342(蓝色)染色。在接种后16小时将纳米颗粒(和作为对照的Lipofectamine3000)引入细胞。在成像之前，将细胞与Hoescht3342和LysotrackerRed一起温育。图C-D显示了条形图，其量化纳米颗粒核与细胞核和内体的共同定位。图7(图A-B)描绘用包括编码GFP的mRNA作为核酸有效负载的纳米颗粒转染的外周血单核细胞(PBMC)的显微图像。该图像证明，用包括核的纳米颗粒可以将mRNA表达延长至16天，所述核具有限定比率的阴离子氨基酸的D-异构体的聚合物和阴离子氨基酸的L-异构体的聚合物。在这种情况下，使用具有2:1比率的聚(D-谷氨酸)与聚(L-谷氨酸)的纳米颗粒核在16天时产生最大表达(图A＝4天；图B＝16天)。图8描绘主题纳米颗粒的示例实施方案的图示。图9描绘主题纳米颗粒的示例实施方案的图示。在这种情况下，纳米颗粒是多层的，具有被第一可脱落层包围的核(其包括第一有效负载)，第一可脱落层被中间层(其包括另外的有效负载)包围，中间层被第二可脱落层包围，第二可脱落层有表面涂层(即，包括外壳)。图10(图A-B)描绘主题纳米颗粒表面涂层的递送分子的示例构造的图示。所描绘的递送分子包括与锚定结构域缀合的靶向配体，所述锚定结构域与纳米颗粒的可脱落层以静电方式相互作用。注意，靶向配本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳米颗粒，其包含核和包封所述核的可脱落层，其中所述核包含：/n(i)阴离子聚合物组合物；/n(ii)阳离子聚合物组合物；/n(iii)阳离子多肽组合物；和/n(iv)核酸和/或蛋白质有效负载，/n其中(a)所述阴离子聚合物组合物包含阴离子氨基酸的D-异构体的聚合物和阴离子氨基酸的L-异构体的聚合物；和/或(b)所述阳离子聚合物组合物包含阳离子氨基酸的D-异构体的聚合物和阳离子氨基酸的L-异构体的聚合物。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20161214 US 62/434,344;20170106 US 62/443,522;20171.一种纳米颗粒，其包含核和包封所述核的可脱落层，其中所述核包含：
(i)阴离子聚合物组合物；
(ii)阳离子聚合物组合物；
(iii)阳离子多肽组合物；和
(iv)核酸和/或蛋白质有效负载，
其中(a)所述阴离子聚合物组合物包含阴离子氨基酸的D-异构体的聚合物和阴离子氨基酸的L-异构体的聚合物；和/或(b)所述阳离子聚合物组合物包含阳离子氨基酸的D-异构体的聚合物和阳离子氨基酸的L-异构体的聚合物。


2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述阴离子聚合物组合物包含选自聚(D-谷氨酸)(PDEA)和聚(D-天冬氨酸)(PDDA)的第一阴离子聚合物；并且包含选自聚(L-谷氨酸)(PLEA)和聚(L-天冬氨酸)(PLDA)的第二阴离子聚合物。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的纳米颗粒，其中所述阳离子聚合物组合物包含选自聚(D-精氨酸)、聚(D-赖氨酸)、聚(D-组氨酸)，聚(D-鸟氨酸)和聚(D-瓜氨酸)的第一阳离子聚合物；并且包含选自聚(L-精氨酸)、聚(L-赖氨酸)、聚(L-组氨酸)、聚(L-鸟氨酸)和聚(L-瓜氨酸)的第二阳离子聚合物。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的纳米颗粒，其中所述阴离子氨基酸的D-异构体的聚合物相对于所述阴离子氨基酸的L-异构体的聚合物以10:1至1:10范围的比率存在。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的纳米颗粒，其中所述阳离子氨基酸的D-异构体的聚合物相对于所述阳离子氨基酸的L-异构体的聚合物以10:1至1:10范围的比率存在。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的纳米颗粒，其中所述可脱落层是阴离子涂层。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的纳米颗粒，其中所述可脱落层是pH和/或谷胱甘肽敏感的。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米颗粒，其中所述可脱落层包含以下中的一种或多种：二氧化硅、类肽、聚半胱氨酸、钙，磷酸钙、硫酸钙、锰、磷酸锰、硫酸锰、镁、磷酸镁、硫酸镁、铁、磷酸铁、硫酸铁、锂、磷酸锂和硫酸锂。


9.根据权利要求8所述的纳米颗粒，其中所述可脱落层是二氧化硅涂层。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的纳米颗粒，其还包含包围所述可脱落层的表面涂层。


11.根据权利要求10所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层包含与所述可脱落层以静电方式相互作用的阳离子组分。


12.根据权利要求10或权利要求11所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层包含以下中的一种或多种：阳离子氨基酸的聚合物、聚(精氨酸)、锚定结构域、阳离子锚定结构域、细胞穿透肽、病毒糖蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖和靶向配体。


13.根据权利要求10-12中任一项所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层是两性离子和多价的。


14.根据权利要求10-13中任一项所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层包含一种或多种靶向配体。


15.根据权利要求14所述的纳米颗粒，其中所述一种或多种靶向配体中的至少一种缀合至与所述可脱落层相互作用的锚定结构域。


16.根据权利要求15所述的纳米颗粒，其中所述锚定结构域是选自RRRRRRRRR(SEQIDNO:15)和HHHHHH(SEQIDNO:16)的阳离子锚定结构域。


17.根据权利要求15或权利要求16所述的纳米颗粒，其中所述锚定结构域通过接头缀合至所述一种或多种靶向配体中的至少一种。


18.根据权利要求17所述的纳米颗粒，其中所述接头不是多肽。


19.根据权利要求17所述的纳米颗粒，其中所述接头为多肽。


20.根据权利要求17-19中任一项所述的纳米颗粒，其中所述接头通过巯基或胺反应性化学与所述靶向配体缀合，和/或所述接头通过巯基或胺反应性化学与所述锚定结构域缀合。


21.根据权利要求17-20中任一项所述的纳米颗粒，其中所述一种或多种靶向配体中的至少一种包含半胱氨酸残基并通过所述半胱氨酸残基与所述接头缀合。


22.根据权利要求14-21中任一项所述的纳米颗粒，其中所述一种或多种靶向配体提供与B家族G蛋白偶联受体(GPCR)的靶向结合。


23.根据权利要求22所述的纳米颗粒，其中所述靶向配体相对于相应的野生型氨基酸序列在一个或多个内部氨基酸位置包含半胱氨酸取代。


24.根据权利要求22或权利要求23所述的纳米颗粒，其中所述靶向配体包含与氨基酸序列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQIDNO:1)具有85％或更高同一性的氨基酸序列。


25.根据权利要求24所述的纳米颗粒，其中所述靶向配体在SEQIDNO:1)所示的氨基酸序列的位置L10、S11和K12中的一处或多处包含半胱氨酸取代。


26.根据权利要求25所述的纳米颗粒，其中所述靶向配体包含氨基酸序列HGEGTFTSDLCKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQIDNO:2)。


27.根据权利要求14-26中任一项所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层包含一种或多种靶向配体，所述靶向配体提供与选自c-Kit、CD27和CD150的细胞表面蛋白的靶向结合。


28.根据权利要求14-27中任一项所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层包含一种或多种选自下组的靶向配体：狂犬病病毒糖蛋白(RVG)片段、ApoE-转铁蛋白、乳铁蛋白、黑素铁蛋白、卵转铁蛋白、L-选择蛋白、E-选择蛋白、P-选择蛋白、PSGL-1、ESL-1、CD44、死亡受体-3(DR3)、LAMP1、LAMP2、Mac2-BP、干细胞因子(SCF)、CD70、含SH2结构域的蛋白1A(SH2D1A)、毒蜥外泌肽-4、GLP-1、靶向α5β1的靶向配体、RGD、转铁蛋白配体、FGF片段、琥珀酸、二膦酸盐、CD90、CD45f、CD34、造血干细胞的趋化脂质、鞘氨醇、神经酰胺、鞘氨醇-1-磷酸、神经酰胺-1-磷酸和任何上述物质的活性靶向片段。


29.根据权利要求14-28中任一项所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层包含干细胞因子(SCF)或其靶向片段，CD70或其靶向片段，及含有SH2结构域的蛋白1A(SH2D1A)或其靶向片段。


30.根据权利要求14-29中任一项所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层包含一种或多种靶向配体，所述靶向配体提供与选自以下的靶细胞的靶向结合：骨髓细胞、造血干细胞(HSC)、造血干细胞和祖细胞(HSPC)、外周血单核细胞(PBMC)、骨髓祖细胞、淋巴祖细胞、T细胞、B细胞、NKT细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞、巨核细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、红系祖细胞、巨核细胞-红系祖细胞(MEP)、共同髓系祖细胞(CMP)、多能祖细胞(MPP)、造血干细胞(HSC)、短期HSC(ST-HSC)、IT-HSC、长期HSC(LT-HSC)、内皮细胞、神经细胞、星形胶质细胞、胰腺细胞、胰岛β细胞、肝细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞、脂肪细胞、肠细胞、结肠细胞和胃细胞。


31.根据权利要求14-29中任一项所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层包含两种或更多种靶向配体，所述靶向配体的组合提供与选自以下的细胞的靶向结合：骨髓细胞、造血干细胞(HSC)、造血干细胞和祖细胞(HSPC)、外周血单核细胞(PBMC)、骨髓祖细胞、淋巴祖细胞、T细胞、B细胞、NKT细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞、巨核细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、红系祖细胞、巨核细胞-红系祖细胞(MEP)、共同髓系祖细胞(CMP)、多能祖细胞(MPP)、造血干细胞(HSC)、短期HSC(ST-HSC)、IT-HSC、长期HSC(LT-HSC)、内皮细胞、神经细胞、星形胶质细胞、胰腺细胞、胰岛β细胞、肝细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞、脂肪细胞、肠细胞、结肠细胞和胃细胞。


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【专利技术属性】
技术研发人员：A·R·沃森，C·福斯特，
申请(专利权)人：利甘达尔股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US