治疗DANON病的基因治疗载体制造技术

本发明专利技术一般涉及与溶酶体相关膜蛋白2(LAMP‑2，也称为CD107b)突变有关的疾病的基因治疗。一方面，本公开提供了一种基因治疗载体，其包含表达盒，该表达盒包含编码LAMP‑2异构体或其功能性变体的转基因，其中该转基因被密码子优化以在人宿主细胞中表达。另一方面，本公开提供了预防、减轻、改善、减少、抑制、消除和/或逆转在有此需要的受试者体内的Danon病或另一种自噬障碍的一种或多种症状的方法，该方法包含向受试者施用本公开的基因治疗载体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】治疗DANON病的基因治疗载体相关申请本申请要求于2018年7月12日提交的美国临时专利申请第62/697,302号的优先权，其整体通过引用并入本文。序列表本申请经由EFS-Web电子提交，包括以.txt格式电子提交的序列表。.txt文件含有一个序列表，名称为“ROPA_011_01WO_SeqList_ST25.txt”，创建于2019年7月11日，大小为约62千字节。该.txt文件中含有的序列表是说明书的一部分，其整体通过引用并入本文。
本专利技术一般涉及与溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2，也称为CD107b)突变有关的疾病的基因治疗。
技术介绍
溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2，也称为CD107b)是编码溶酶体相关膜蛋白的基因。基因的选择性剪接产生三种异构体：LAMP-2A、LAMP-2B和LAMP-2C。LAMP-2的功能丧失突变与人类疾病有关，包括Danon病，一种与自噬受损有关的家族性心肌病。如Hashem等人的《干细胞(StemCells)》，2015年7月；33(7)：2343-50中所述，国际专利申请公开第WO2017127565A1号公开了LAMP-2在来源于LAMP-2突变患者的人诱导多能干细胞(hiPSCs)中的过表达，引起氧化应激水平降低和凋亡细胞死亡，从而证实了LAMP-2B在疾病病理生理学中的重要性。在本领域中仍然需要用于LAMP-2的基因治疗载体。本公开提供了此类基因治疗载体、其使用方法、药物组合物等。
技术实现思路
本公开提供了包含编码LAMP-2多肽的多核苷酸序列的改进的基因治疗载体、其使用方法、药物组合物等。一方面，本公开提供了一种基因治疗载体，其包含表达盒，该表达盒包含编码溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)异构体或其功能性变体的转基因，其中该转基因被密码子优化以在人宿主细胞中表达。在一个实施例中，表达盒含有比SEQID:2少的CpG位点。在一个实施例中，表达盒含有比SEQID:2少的隐蔽剪接位点。在一个实施例中，表达盒编码比SEQID:2少的选择性开放阅读框。在一个实施例中，转基因与选自SEQIDNO:3至SEQIDNO:5的序列具有至少95％的同一性。在一个实施例中，转基因与选自SEQIDNO:3至SEQIDNO:5的序列具有至少99％的同一性。在一个实施例中，转基因包含选自SEQIDNO:3至SEQIDNO:5的序列。在一个实施例中，转基因与选自SEQIDNO:3的序列具有至少95％的同一性。在一个实施例中，转基因与选自SEQIDNO:3的序列具有至少99％的同一性。在一个实施例中，转基因包含选自SEQIDNO:3的序列。在一个实施例中，表达盒包含与转基因可操作地连接的共有最优Kozak序列，其中任选地，共有最优Kozak序列包含SEQIDNO:6。在一个实施例中，表达盒包含与转基因可操作地连接的全长polyA序列，其中任选地，全长polyA序列包含SEQIDNO:7。在一个实施例中，表达盒不包含处于能够产生选择性mRNA的转基因5'端的起始位点。在一个实施例中，表达盒在5'至3'方向上包含可操作地连接的第一反向末端重复序列、增强子/启动子区、共有最优Kozak序列、转基因、包括全长polyA序列的3'非转译区和第二反向末端重复序列。在一个实施例中，增强子/启动子区在5'至3'方向上包含CMVIE增强子和鸡β-肌动蛋白启动子。在一个实施例中，表达盒与选自SEQIDNO:8至SEQIDNO:10的序列具有至少95％的同一性。在一个实施例中，表达盒与选自SEQIDNO:8至SEQIDNO:10的序列具有完全同一性。在第二方面，本公开提供了一种预防、减轻、改善、减少、抑制、消除和/或逆转在有此需要的受试者体内的Danon病或另一种自噬障碍的一种或多种症状的方法，该方法包含向受试者施用本公开的任何基因治疗载体。在一个实施例中，经由选自由静脉内、动脉内、心内、冠状动脉内、心肌内、肾内、尿道内、硬膜外和肌内组成的群组的途径施用载体。在一个实施例中，自噬障碍选自由以下组成的群组：终末期心力衰竭、心肌梗塞、药物毒性、糖尿病、终末期肾衰竭和衰老。在一个实施例中，受试者是人。在一个实施例中，受试者正表现出Danon病或另一种自噬障碍的症状。在一个实施例中，已鉴定受试者具有降低的或不可检测的LAMP-2表达。在一个实施例中，已鉴定受试者具有突变的LAMP-2基因。在第三方面，本公开提供了一种用于预防、减轻、改善、减少、抑制、消除和/或逆转Danon病或另一种自噬障碍的一种或多种症状的药物组合物，该药物组合物包含本公开的任何基因治疗载体。通过下面的详细描述和权利要求，本专利技术的其他特征和优点将显而易见并被其涵盖。附图说明图1A提供了本公开的病毒载体的示例性实施例的图。图1B提供了腺相关病毒(AAV)基因治疗载体的表达盒的示例性实施例的图。图2示出了用于测试和比较野生型LAMP-2B构建体与密码子优化的LAMP-2B构建体的基于质粒的绿色荧光蛋白(GFP)报告系统的表达盒。图3是示出LAMP-2B构建体的转染表达效率的图表，该LAMP-2B构建体使用基于质粒的GFP报告系统的转染进行测试并以每孔GFP+细胞进行测量。将野生型LAMP-2B构建体(WT)与三个密码子优化(“CO”)的构建体CO1、CO2和CO3以及无载体对照(标记为“仅ViaFect”)进行比较。图4是示出在用基于质粒的GFP报告系统转染的细胞中用于测试LAMP-2B构建体的基因表达水平的图表，其以吸光度单位(A.U.)中GFP+细胞的平均GFP强度测量。将野生型LAMP-2B构建体(WT)转染的细胞的GFP表达与三个密码子优化(“CO”)的构建体CO1、CO2和CO3以及无载体对照(标记为“仅ViaFect”)的GFP表达进行比较。图5示出了用基于质粒的GFP报告系统转染后两天诱导性多能干细胞(iPSC)分化心肌细胞的免疫荧光图像。未用DNA或用表达野生型LAMP-2B、CO1变体、CO2变体或CO3变体的LAMP-2B构建体转染细胞。图6示出了用基于质粒的GFP报告系统转染后七天iPSC分化心肌细胞的免疫荧光图像。未用DNA或用表达野生型LAMP-2B、CO1变体、CO2变体或CO3变体的LAMP-2B构建体转染细胞。图7A示出了用包含野生型LAMP-2Bv1.0转基因(AAV91.0)、优化变体LAMP-2Bv1.2转基因(AAV91.2)或GFP转基因(AAV9GFP)的AAV9病毒载体转导的CHO-Lec2细胞中人LAMP-2B蛋白的免疫印迹。还包括分子量标记(MW)和对照LAMP-2B重组蛋白样品(LAMP2B(阳性对照))。图7B示出了通过ELISA对用AAV9野生型LAMP-2B(v1.0)、AAV本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因治疗载体，所述基因治疗载体包含表达盒，所述表达盒包含编码溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)异构体或其功能性变体的转基因，其中所述转基因被优化以在人宿主细胞中表达。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180712 US 62/697,3021.一种基因治疗载体，所述基因治疗载体包含表达盒，所述表达盒包含编码溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)异构体或其功能性变体的转基因，其中所述转基因被优化以在人宿主细胞中表达。


2.根据权利要求1所述的基因治疗载体，其中所述转基因经密码子优化以在人宿主细胞中表达。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的基因治疗载体，其中所述表达盒含有比SEQID:2少的CpG位点。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的基因治疗载体，其中所述表达盒含有比SEQID:2少的隐蔽剪接位点。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的基因治疗载体，其中所述表达盒编码比SEQID:2少的选择性开放阅读框。


6.根据权利要求1至4中任一项所述的基因治疗载体，其中所述转基因与选自SEQIDNO:3至SEQIDNO:5的序列具有至少95％的同一性或至少99％的同一性。


7.根据权利要求6所述的基因治疗载体，其中所述转基因包含选自SEQIDNO:3至SEQIDNO:5的序列。


8.根据权利要求7所述的基因治疗载体，其中所述转基因与SEQIDNO:3具有至少95％的同一性或与SEQIDNO:3相同。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的基因治疗载体，其中所述表达盒包含共有最优Kozak序列，其中任选地，所述共有最优Kozak序列包含SEQIDNO:6。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的基因治疗载体，其中所述表达盒包含全长polyA序列，其中任选地，所述全长polyA序列包含SEQIDNO:7。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的基因治疗载体，其中所述表达盒不包含处于能够产生选择性mRNA的转基因5'端的起始位点。


12.根据权利要求1至11中任一项所述的基因治疗载体，其中所述表达盒在5'至3'方向上包含第一反向末端重复序列、增强子/启动子区、内含子、共有最优Kozak序列、转基因、包括全长polyA序列的3'非转译区和第二反向末端重复序列。


13.根据权利要求12所述的基因治疗载体，其中所述增强子/启动子区在5'至3'方向上包含CMVIE增强子和鸡β-肌动蛋白启动子，并且任选地，其中所述增强子/启动子区进一步包含鸡β-肌动蛋白基因的第一外显子和第一内含子以及兔β-珠蛋白基因的剪接受体。


14.根据权利要求1至13中任一项所述的基因治疗载体，其中所述表达盒与选自SEQIDNO:8至SEQIDNO:10的序列具有至少95％的同一性。


15.根据权利要求14所述的基因治疗载体，其中所述表达盒与选自SEQIDNO:8至SEQIDNO:10的序列具有完全同一性。


16.根据权利要求14所述的基因治疗载体，其中所述表达盒与SEQIDNO:3具有至少95％的同一性或与SEQIDNO:8相同。


17.根据权利要求1至16中任一项所述的基因治疗载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。


18.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至17中任一项所述的基因治疗载体。


19.一种治疗或预防在有此需要的受试者体内Danon病或另一种自噬障碍的方法，所述方法包含向所述受试者施用根据权利要求1至17中任一项所述的基因治疗载体或根据权利要求18所述的药物组合物。


20.根据权利要求19所述的方法，其中所述载体或药物组合物经由选自由静脉内、动脉内、心内、冠状动脉内、心肌内、肾内、尿道内、硬膜外和肌内组成的群组的途径施用。


21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述自噬障碍选自由以下组成的群组：终末期心力衰竭、心肌梗塞、药物毒性、糖尿病、终末期肾衰竭和衰老。


22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。


23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述受试者正表现出Danon病或另一种自噬障碍的症状。


24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述受试者已被鉴定为具有降低的或不可检测的LAMP-2表达。


25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法，其中所述受试者已被鉴定为具有突变的LAMP-2基因。


26.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中与未治疗的受试者相比，所述基因治疗载体的施用引起心脏内LAMP-2B多核苷酸和/或LAMP-2B蛋白的表达增加。


27.根据权利要求19至26中任一项所述的方法，其中与未治疗的受试者相比，所述基因治疗载体的施用引起心脏内LAMP-2B多核苷酸和/或LAMP-2B蛋白的表达增加至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2.0倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍、至少约2.4倍、至少约2.5倍、至少约3倍或至少约4倍。


28.根据权利要求19至27中任一项所述的方法，其中与未治疗的受试者的肝脏内的表达相比，所述基因治疗载体的施用引起肝脏内LAMP-2B多核苷酸和/或LAMP-2B蛋白的表达增加至多约1.1倍、至多约1.2倍、至多约1.3倍、至多约1.4倍或至多约1.5倍。


29.一种在受试者体内表达LAMP-2B的方法，所述方法包含向所述受试者全身施用腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体包含表达盒，所述表达盒包含与SEQIDNO:3具有至少95％的同一性或与SEQIDNO:3相同的转基因，所述转基因与增强子/启动子区可操作地连接，其中与施用AAV载体之前的LAMP-2B表达或未治疗的对照受试者体内的LAMP-2B表达相比，向受试者全身施用AAV载体引起LAMP-2B表达增加。


30.根据权利要求29所述的方法，其中所述全身施用包含静脉内施用。


31.根据权利要求29或权利要求30所述的方法，其中所述AAV载体以介于约1×1012和5×1014个载体基因组(vg)的AAV载体/千克(vg)受试者总体重(vg/kg)之间的剂量施用。


32.根据权利要求31所述的方法，其中所述AAV载体以介于约1×1013和5×1014vg/kg之间的剂量施用。


33.根据权利要求31所述的方法，其中所述AAV载体以介于约5×1013和3×1014vg/kg之间的剂量施用。


34.根据权利要求31所述的方法，其中所述AAV载体以介于约5×1013和1×1014vg/kg之间的剂量施用。


35.根据权利要求29至34中任一项所述的方法，其中所述增强子/启动子区在5'至3'方向上包含CMVIE增强子和鸡β-肌动蛋白启动子，并且任选地，其中所述增强子/启动子区进一步包含鸡β-肌动蛋白基因的第一外显子和第一内含子以及兔β-珠蛋白基因的剪接受体。


36.根据权利要求29至35中任一项所述的方法，其中所述表达盒包含与所述转基因可操作地连接的共有最优Kozak序列，其中任选地，所述共有最优Kozak序列包含SEQIDNO:6。


37.根据权利要求29至36中任一项所述的方法，其中所述表达盒包含与所述转基因可操作地连接的全长polyA序列，其中任选地，所述全长polyA序列包含SEQIDNO:7。


38.根据权利要求29至37中任一项所述的方法，其中所述表达盒不包含处于能够产生选择性mRNA的转基因5'端的起始位点。


39.根据权利要求29至38中任一项所述的方法，其中所述表达盒在5'至3'方向上包含可操作地连接的第一反向末端重复序列、增强子/启动子区、内含子、共有最优Kozak序列、转基因、包括全长polyA序列的3'非转译区和第二反向末端重复序列，其中所述表达盒不包含处于所述转基因的起始密码子5'端的起始密码子。


40.根据权利要求29至39中任一项所述的方法，其中所述受试者是灵长类动物。


41.根据权利要求29至40中任一项所述的方法，其中所述受试者已被鉴定为具有或疑似具有降低的或不可检测的LAMP-2表达。


42.根据权利要求29至41中任一项所述的方法，其中所述受试者具有突变的LAMP-2基因。


43.根据权利要求29至42中任一项所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·喀拉瓦拉，S·摩尔，D·里克斯，
申请(专利权)人：火箭制药有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US