一种构建载PLK1 SiRNA的金立方的方法技术

本发明专利技术属于纳米复合平台技术领域，公开了一种构建载PLK1 SiRNA的金立方的方法。基于金立方供氧纳米复合平台的构建(Au CC@mSiO2@Mn‑Cdot,缩写为CCmMC)；使用种子液生长法和离子置换法制备出直径约50~100 nm的金立方，再通过优化的溶胶‑凝胶法使金立方表面包覆一层介孔硅；接着通过电荷吸附法使掺杂锰的碳点进入介孔硅的孔道中；载PLK1 SiRNA的金立方供氧纳米复合平台的构建(CCmMC/PLK1 SiRNA)；对金立方供氧纳米复合平台的电荷改性，使PLK1 SiRNA连接到纳米平台的表面，实现靶基因转录后表达沉默从而达到特异性调控的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种构建载PLK1SiRNA的金立方的方法
本专利技术属于纳米复合平台
，尤其涉及了一种构建载PLK1SiRNA的金立方的方法。
技术介绍
借助于多功能纳米复合平台的应用，靶向基因治疗在治疗骨肿瘤领域日益受到重视。另一方面，特异性研究基因功能的工具：小干扰RNA(SmallinterferingRNA,SiRNA)，为基因表达和信号通路靶点的精确调控提供了可能。小干扰RNA是一类由21-23个核苷酸构成的双链RNA，通过RNA干扰机制（RNAi）以特定序列的方式诱导靶向mRNA的降解，沉默特异性靶基因表达从而达到特异性调控的目的。PLK1(Polo-likeKinase1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，受到细胞周期的严格调控，但在骨肉瘤、乳腺癌等肿瘤中常出现过表达。PLK1的过表达常导致致癌转化，且与骨肉瘤进展转移和癌症患者的预后密切相关，表明PLK1正逐渐成为骨肉瘤治疗新的靶点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种构建载PLK1SiRNA的金立方的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种构建载PLK1SiRNA的金立方的方法，包括如下具体步骤：步骤1、基于金立方供氧纳米复合平台的构建(AuCC@mSiO2@Mn-Cdot,缩写为CCmMC)；使用种子液生长法和离子置换法制备出直径约50~100nm的金立方，再通过优化的溶胶-凝胶法使金立方表面包覆一层介孔硅；接着通过电荷吸附法使掺杂锰的碳点进入介孔硅的孔道中；步骤2、载PLK1SiRNA的金立方供氧纳米复合平台的构建(CCmMC/PLK1SiRNA)；对金立方供氧纳米复合平台的电荷改性，使PLK1SiRNA连接到纳米平台的表面，实现靶基因转录后表达沉默从而达到特异性调控的目的。进一步，步骤1还包括如下具体步骤：步骤1.1、合成金纳米立方体；步骤1.2、合成金立方体（AuCC）；步骤1.3、AuCCs@mSiO2（CCm）表面的合成与化学改性；步骤1.4、合成AuCCs@mSiO2@Mn-Cdots（CCmMC）；进一步，步骤1.1还包括如下具体步骤：步骤1.1.1、制备的种子溶液在30℃孵育1h后，在100mL圆底烧瓶中将8mL100mMCTAB溶液与40mL双蒸水混合；步骤1.1.2、依次加入1mL的10mMHAuCl4溶液和4.75mL的100mM抗坏血酸溶液；步骤1.1.3、将种子液稀释10倍，加25μl稀释的种子液于混合溶液中，均匀混合，孵育过夜后离心（6000rpm，15min）两次，弃去上清液后收集金纳米颗粒，重悬于9mLDDM中。进一步，步骤1.2还包括如下具体步骤：步骤1.2.1、使用Votex将4mL的50pMAu纳米立方体与400μL2〜5mMAgNO3溶液混合，反应生成Au@Ag核-壳纳米立方体；步骤1.2.2、将0.01mMHAuCl4溶液4mL注射到Au@Ag核-壳纳米管悬液中，加入4mL100mMCTAB和870μL100mM抗坏血酸，速度为20μL/min，温度为30℃；步骤1.2.3、混合溶液孵育20min，6000rpm离心10min，2次；步骤1.2.4、将沉淀的AuCCS重悬于4mLDDW中备用。进一步，步骤1.3还包括如下具体步骤：步骤1.3.1、将1mLCTAB（100mM)滴加到4mLAuCCs悬浮液中，搅拌1h，将氨加入混合液，调整pH至10；步骤1.3.2、分3次加入TEOS，以30min的间隔分别加入50μL，70μL和90μL，每次加入后均调整pH，混合溶液在室温下反应10h，10000rpm离心15min，2次后弃去上清液，获得AuCCs@mSiO2沉淀，用于完全除去CTAB；步骤1.3.3、将沉淀重悬于4mL乙醇中，使用HCL将pH调节至小于1，静置2h；离心10000rpm，15min，重悬于乙醇，调节pH，重复3次后最后一次重悬于10mLPBS；步骤1.3.4、将0.5mLAPTES加入上述溶液中，油浴90°C，24小时，以实现氨基修饰；离心，乙醇洗涤，收集CCm-NH2，以确保去除残留的APS。进一步，步骤1.4还包括如下具体步骤：步骤1.4.1、以Mn-Pc为原料，采用溶剂热处理法合成Mn-Cdots；将Mn-PC溶于无水乙醇，加热至180-200℃24h，冷却至室温后使用微孔0.22膜过滤得到Mn-Cdots，再于乙醇多次混合，去除游离的Mn-PC，重悬于乙醇；步骤1.4.2、用超声将CCm-NH2分散于10mLPBS中1h，以达到均匀分布；将Mn-Cdots溶液加入CCm-NH2溶液中，剧烈搅拌12h；通过离心-漂洗循环收集CCmMC，保存于4℃。进一步，步骤2还包括如下具体步骤：步骤2.1.、AuCCs@mSiO2的阳离子修饰；步骤2.2.、获得针对PLK1的siRNA；步骤2.3、结合阳离子修饰的AuCCs@mSiO2和PLK1的siRNA。进一步，步骤2.1还包括如下具体步骤：步骤2.1.1、将乙二胺(0.65mL，10mmol)或N、N-二甲基乙二胺(0.65mL，10mmol)溶液用6.0mol／L的HCl调节至pH4.8；步骤2.1.2、加入新制备的AuCCs@mSiO2，并加人18.1mgEDC/11.0mgNHS(94µmol)，室温搅拌2h；步骤2.1.3、醋酸缓冲液调节液体PH至4.75，用5µmol的滤膜过滤反应液，随后用截留分子量为30kDa的超滤离心管离心(15°C，5000rpm，30min)除去未反应物质。进一步，步骤2.2还包括如下具体步骤：步骤2.2.1、从GenBank（编码：NM_005030)获得对应于PLK1基因的编码区域的序列（F：5’-CCAUACGAGCUGCUUAAtt-3’，R:5’-UUAAGCUCAUGAUGGtt-3’），将siRNA寡核苷酸以100µM的浓度溶解在去离子水中。进一步，步骤2.3还包括如下具体步骤：步骤2.3.1、将上述制备的AuCCs@mSiO2溶液和siRNA按照预设的N/P=20进行混合，室温下共孵育15-20分钟，可成功构建载PLK1SiRNA的金立方。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本申请通过对金立方纳米复合平台的电荷改性，使PLK1-SiRNA连接到纳米平台的表面，通过沉默骨肉瘤转移进展相关的靶基因以达到特异性调控目的，故可有效增强其抗骨肉瘤的效果。附图说明图1为本专利技术中CCmMC构建示意图；图2为本专利技术中iRGD-CCmMC/PLK1SiRNA的构建示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建载PLK1 SiRNA的金立方的方法，其特征在于：包括如下具体步骤：/n步骤1、基于金立方供氧纳米复合平台的构建 (Au CC@mSiO2@Mn-Cdot,缩写为CCmMC)；使用种子液生长法和离子置换法制备出直径约50~100 nm的金立方，再通过优化的溶胶-凝胶法使金立方表面包覆一层介孔硅；接着通过电荷吸附法使掺杂锰的碳点进入介孔硅的孔道中；/n步骤2、载PLK1 SiRNA的金立方供氧纳米复合平台的构建 (CCmMC/PLK1 SiRNA)；对金立方供氧纳米复合平台的电荷改性，使PLK1 SiRNA连接到纳米平台的表面，实现靶基因转录后表达沉默从而达到特异性调控的目的。/n

【技术特征摘要】
1.一种构建载PLK1SiRNA的金立方的方法，其特征在于：包括如下具体步骤：
步骤1、基于金立方供氧纳米复合平台的构建(AuCC@mSiO2@Mn-Cdot,缩写为CCmMC)；使用种子液生长法和离子置换法制备出直径约50~100nm的金立方，再通过优化的溶胶-凝胶法使金立方表面包覆一层介孔硅；接着通过电荷吸附法使掺杂锰的碳点进入介孔硅的孔道中；
步骤2、载PLK1SiRNA的金立方供氧纳米复合平台的构建(CCmMC/PLK1SiRNA)；对金立方供氧纳米复合平台的电荷改性，使PLK1SiRNA连接到纳米平台的表面，实现靶基因转录后表达沉默从而达到特异性调控的目的。


2.根据权利要求1所述的构建载PLK1SiRNA的金立方的方法，其特征在于：步骤1还包括如下具体步骤：
步骤1.1、合成金纳米立方体；
步骤1.2、合成金立方体（AuCC）；
步骤1.3、AuCCs@mSiO2（CCm）表面的合成与化学改性；
步骤1.4、合成AuCCs@mSiO2@Mn-Cdots（CCmMC）。


3.根据权利要求2所述的构建载PLK1SiRNA的金立方的方法，其特征在于：步骤1.1还包括如下具体步骤：
步骤1.1.1、制备的种子溶液在30℃孵育1h后，在100mL圆底烧瓶中将8mL100mM十六烷基三甲基溴化铵/西曲溴铵（CTAB）溶液与40mL双蒸水混合；
步骤1.1.2、依次加入1mL的10mM四氯金酸（HAuCl4）溶液和4.75mL的100mM抗坏血酸溶液；
步骤1.1.3、将种子液稀释10倍，加25μl稀释的种子液于混合溶液中，均匀混合，孵育过夜后离心（6000rpm，15min）两次，弃去上清液后收集金纳米颗粒，重悬于9mLDDM中。


4.根据权利要求2所述的构建载PLK1SiRNA的金立方的方法，其特征在于：步骤1.2还包括如下具体步骤：
步骤1.2.1、使用Votex涡旋混合器将4mL的50pMAu纳米立方体与400μL2〜5mMAgNO3溶液混合，反应生成Au@Ag核-壳纳米立方体；
步骤1.2.2、将0.01mMHAuCl4溶液4mL注射到Au@Ag核-壳纳米管悬液中，加入4mL100mMCTAB和870μL100mM抗坏血酸，速度为20μL/min，温度为30℃；
步骤1.2.3、混合溶液孵育20min，6000rpm离心10min，2次；
步骤1.2.4、将沉淀的AuCCS重悬于4mL二蒸水（DDW）中备用。


5.根据权利要求2所述的构建载PLK1SiRNA的金立方的方法，其特征在于：步骤1.3还包括如下具体步骤：
步骤1.3.1、将1mLCTAB（100mM)滴加到4mLAuCCs悬浮液中，搅拌1h，将氨加入混合液，调整pH至10；
步骤1.3.2、分3次加入TEOS，以30min的间隔分别加入50μL，70μL和90μL，每次加入后均调整pH，混合溶液在室温下反应10h，10000rpm离心15min，2次后弃去上清液，获得AuCCs@mS...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宏亮，郭开今，蔡大钊，王子豪，顾文祥，
申请(专利权)人：徐州医科大学附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32