用于常染色体显性疾病的基因编辑制造技术

本公开提供了用于治疗受试者的常染色体显性疾病的方法。在一些方面，所述方法包括使用具有一对独特的引导RNA序列的基因编辑酶，所述引导RNA序列在细胞中靶向常染色体显性疾病相关基因的突变型和野生型形式以进行破坏，然后向细胞提供野生型常染色体显性疾病相关基因cDNA，所述基因经密码子修饰以逃避引导RNA的识别。这些方法广泛地适用于任何常染色体显性疾病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于常染色体显性疾病的基因编辑相关申请的交叉引用本申请要求2018年3月23日提交的美国临时申请第62/647,415号的优先权，其通过引用整体并入本文。政府许可权本专利技术是在由美国国家卫生研究院(NIH)颁发的RO1EY024698拨款下借助政府资助进行的。政府对本专利技术具有一定权利。序列表本申请包含以ASCII格式以电子方式提交并据此通过引用整体并入的序列列表。所述ASCII副本创建于2019年3月21日，命名为01001_006660-WO0_ST25.txt，并且大小为37KB。专利
本公开涉及使用基于CRISPR的方法在患者中进行基因编辑，以治疗常染色体显性疾病。专利技术背景对于许多对生活质量有深重的负面影响的常染色体显性或隐性疾病，目前尚无治愈方法。显性形式的视网膜色素变性(RP)、视锥杆营养不良和青少年黄斑变性是影响眼睛的显性常染色体疾病的主要实例。视网膜变性疾病影响至少900万美国人(FriedmanDS等人ArchOphthalmol.2004年4月；122(4):564-72；SchmierJK等人Pharmacoeconomics.2006；24(4):319-34)。最具破坏性的视网膜变性疾病是视网膜色素变性(RP)，这是一种常见的遗传性神经变性疾病，影响到全世界150万人，并且对于该疾病，治疗不够充足。RP是一种变性眼部疾病，可导致视网膜变性和视力下降。视紫红质基因(RHO)的遗传突变是常染色体显性RP的最常见的原因，占病例的20-30％。目前，尚无治愈RP的方法。这些常染色体显性疾病的特征在于存在表达缺陷蛋白的突变基因。因此，这些疾病不容易接受简单地添加正常健康基因(所谓的“基因补充(genesupplementation)”或“基因添加(geneaddition)”)的疗法，因为致病基因和蛋白质仍然存在。RP的基因疗法在概念验证动物模型中进行了测试，并且后来被用作临床治疗，在临床治疗中其改善了多达一半患者的视力。在这些试验中，患者的遗传异常通过基因补充方法得到纠正(即，通过野生型(wt)基因的过表达拯救)。最初，基因补充似乎起作用，因为患者经历了功能性补求，但随访检查显示光感受器持续退化，并且视力下降在3年中进行(Cideciyan等人ProcNatlAcadSciUSA.2013年2月5日；110(6):E517-25；Bainbridge等人NEnglJMed.2015年5月14日；372(20):1887-97；Jacobson等人NEnglJMed.2015年5月14日；372(20):1920-6)。目前针对其它RP基因的基因疗法试验也采用了基因补充的方法，并且除非失败的原因得到解决，否则可能会面临类似的障碍。由于补充wt基因会使患者的突变型基因保持完整，因此尽管存在wt基因，但突变型基因的存在会持续引发持续的损害。Best卵黄状黄斑营养不良(VMD)是致盲性黄斑病症，其由编码钙依赖性氯离子(Cl-)通道的Bestrophin-1(BEST1)中的250多种常染色体显性点突变引起。BEST1突变降低或消除通道流出Cl-离子的能力，导致液体在视网膜下空间积聚。设计该疾患的治疗有两个主要障碍：1)大多数VMD病是常染色体显性的；和2)BEST1突变具有极大的异质性。因此，靶向特定突变的常规患者特异性疗法不是实用的治疗选项。显性病症比隐性病症难治疗得多。事实上，目前还没有针对显性遗传病症的有效治疗方法。本方法解决了未满足的需求，并且可以普遍应用于所有具有疾病相关基因突变的患者。所述方法克服了常规患者特异性基因疗法仅治疗常染色体隐性疾病的局限性，并且可广泛适用于任何显性疾病。
技术实现思路
在一个实施方案中，本公开涉及用于修饰细胞中常染色体显性疾病相关基因的方法，所述方法包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或进一步由以下步骤组成：将细胞与至少一种类型的编码针对常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统的载体接触，其中所述常染色体显性疾病相关基因涉及或纠正眼部疾病。在一个方面，CRISPR-Cas系统包含在至少一种类型的载体中，所述载体包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和(iii)编码Cas核酸酶的第三序列，其中Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。细胞的非限制性实例包括动物细胞、哺乳动物细胞、犬科动物细胞、猫科动物细胞、马科动物细胞和人细胞。在一个实施方案中，第一引导RNA包含选自SEQIDNO:40、SEQ.IDNO.41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48或SEQIDNO:49的核苷酸序列或其各自的等同物。在另一方面，本公开提供了用于修饰细胞中的常染色体显性疾病相关基因的方法，所述方法包括以下步骤，或者基本上由以下步骤组成，或者进一步由由以下步骤组成：将细胞与至少一种类型的编码针对常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统的载体接触，其中所述常染色体显性疾病相关基因涉及或纠正眼部疾病。一方面，CRISPR-Cas系统包含在至少一种类型的载体中，所述载体包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交，和(ii)编码催化缺陷型Cas核酸酶(dCas)的第二序列。细胞的非限制性实例包括动物细胞、哺乳动物细胞、犬科动物细胞、猫科动物细胞、马科动物细胞和人细胞。在一个实施方案中，第二引导RNA包含选自SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38或SEQIDNO:39的核苷酸序列或其各自的等同物。一方面，本公开提供了用于治疗受试者的常染色体显性眼病的方法，所述方法包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或进一步由以下步骤组成：向受试者施用治疗有效量的至少一种类型的载体，所述载体编码针对或纠正受试者中常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统。一方面，CRISPR-Cas系统包含在至少一种类型的载体中，所述载体包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和(iii)编码Cas核酸酶的第三序列，其中Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。受试者的非限制性实例包括动物、哺乳动物、犬科动物、猫科动物、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于修饰细胞中的常染色体显性疾病相关基因的方法，所述方法包括：/n将所述细胞与至少一种类型的编码针对所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统的载体接触，其中所述常染色体显性疾病相关基因涉及眼病，其中所述至少一种类型的载体包含：/n(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；/n(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和，/n(iii)编码Cas核酸酶的第三序列，/n其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180323 US 62/647,4151.一种用于修饰细胞中的常染色体显性疾病相关基因的方法，所述方法包括：
将所述细胞与至少一种类型的编码针对所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统的载体接触，其中所述常染色体显性疾病相关基因涉及眼病，其中所述至少一种类型的载体包含：
(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；
(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和，
(iii)编码Cas核酸酶的第三序列，
其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一引导RNA包含选自SEQIDNO:40、SEQ.IDNO.41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48或SEQIDNO:49的核苷酸序列或其各自的等同物。


3.一种用于修饰细胞中的常染色体显性疾病相关基因的方法，所述方法包括：将所述细胞与至少一种类型的编码针对所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统的载体接触，其中所述常染色体显性疾病相关基因与眼病相关，其中所述至少一种类型的载体包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与所述常染色体显性疾病相关中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；和，(ii)编码催化缺陷型Cas核酸酶(dCas)的第二序列；
其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。


4.如权利要求3所述的方法，其中所述第二引导RNA包含选自SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38或SEQIDNO:39的核苷酸序列或其各自的等同物。


5.如权利要求1或3所述的方法，其中所述细胞是诱导的多潜能干细胞(iPSC)。


6.如权利要求5所述的方法，其中所述iPSC源自受试者的成纤维细胞。


7.如权利要求5所述的方法，所述方法还包括培养所述iPSC以分化成视网膜色素上皮(RPE)细胞。


8.如权利要求7所述的方法，所述方法还包括向受试者施用所述RPE细胞。


9.如权利要求8所述的方法，其中所述RPE细胞对于所述受试者是自体的。


10.如权利要求8所述的方法，其中所述RPE细胞通过视网膜下移植来施用。


11.如权利要求1或3所述的方法，其中所述细胞对于所述SNP是杂合的。


12.如权利要求1或3所述的方法，其中所述细胞对于具有突变型等位基因和野生型等位基因的所述常染色体显性疾病相关基因是杂合的。


13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述常染色体显性疾病相关基因包含选自SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32或SEQIDNO:33的序列或其各自的等同物。


14.如权利要求1或3至13中任一项所述的方法，其中与所述常染色体显性疾病相关基因杂交的所述第一引导RNA包含SEQIDNO:31的序列。


15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶不切割或不靶向编码所述常染色体显性疾病相关基因的所述野生型等位基因。


16.一种用于治疗受试者的常染色体显性眼病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的至少一种类型的载体，所述载体编码针对所述受试者中常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统，其中所述至少一种类型的载体包含：
(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因中单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；
(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和，
(iii)编码Cas核酸酶的第三序列，
其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。


17.一种用于治疗受试者的常染色体显性眼病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的至少一种类型的载体，所述载体编码针对所述受试者中常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统，其中所述至少一种类型的载体包含：
(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；和，
(ii)编码催化缺陷型Cas核酸酶(dCas)的第二序列，
其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。


18.如权利要求16或17所述的方法，其中所述受试者对于所述SNP是杂合的。


19.如权利要求16或17所述的方法，其中所述受试者对于具有突变型等位基因和野生型等位基因的所述常染色体显性疾病相关基因是杂合的。


20.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述SNP的变体和所述突变型等位基因在同一条染色体上。


21.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述SNP存在于所述常染色体显性疾病相关基因的非编码区中。


22.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述SNP存在于所述常染色体显性疾病相关基因的转录起始位点(TSS)区域中。


23.如权利要求1或16所述的方法，其中所述Cas核酸酶是Cas切口酶。


24.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶是Cas9。


25.如权利要求3或17所述的方法，其中所述dCas与阻遏物结构域融合。


26.如权利要求25所述的方法，其中所述阻遏物结构域是Krüppel相关盒(KRAB)结构域。


27.如权利要求3或17所述的方法，其中所述第一引导RNA包含至少一个PUF(PumiliomRNA结合因子)结合序列。


28.如权利要求27所述的方法，其中所述至少一个PUF结合序列与PUF-KRAB结合。


29.如权利要求1、3、16或17中任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：WH·吴，YT·蔡，S·H·曾，
申请(专利权)人：纽约市哥伦比亚大学理事会，
类型：发明
国别省市：美国;US