用于常染色体显性疾病的基因编辑制造技术

本公开提供了用于治疗受试者的常染色体显性疾病的方法。在一些方面，所述方法包括使用具有一对独特的引导RNA序列的基因编辑酶，所述引导RNA序列在细胞中靶向常染色体显性疾病相关基因的突变型和野生型形式以进行破坏，然后向细胞提供野生型常染色体显性疾病相关基因cDNA，所述基因经密码子修饰以逃避引导RNA的识别。这些方法广泛地适用于任何常染色体显性疾病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于常染色体显性疾病的基因编辑相关申请的交叉引用本申请要求2018年3月23日提交的美国临时申请第62/647,415号的优先权，其通过引用整体并入本文。政府许可权本专利技术是在由美国国家卫生研究院(NIH)颁发的RO1EY024698拨款下借助政府资助进行的。政府对本专利技术具有一定权利。序列表本申请包含以ASCII格式以电子方式提交并据此通过引用整体并入的序列列表。所述ASCII副本创建于2019年3月21日，命名为01001_006660-WO0_ST25.txt，并且大小为37KB。专利
本公开涉及使用基于CRISPR的方法在患者中进行基因编辑，以治疗常染色体显性疾病。专利技术背景对于许多对生活质量有深重的负面影响的常染色体显性或隐性疾病，目前尚无治愈方法。显性形式的视网膜色素变性(RP)、视锥杆营养不良和青少年黄斑变性是影响眼睛的显性常染色体疾病的主要实例。视网膜变性疾病影响至少900万美国人(FriedmanDS等人ArchOphthalmol.2004年4月；122(4):564-72；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于修饰细胞中的常染色体显性疾病相关基因的方法，所述方法包括：/n将所述细胞与至少一种类型的编码针对所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统的载体接触，其中所述常染色体显性疾病相关基因涉及眼病，其中所述至少一种类型的载体包含：/n(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；/n(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和，/n(iii)编码Cas核酸酶的第三序列，/n其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180323 US 62/647,4151.一种用于修饰细胞中的常染色体显性疾病相关基因的方法，所述方法包括：
将所述细胞与至少一种类型的编码针对所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统的载体接触，其中所述常染色体显性疾病相关基因涉及眼病，其中所述至少一种类型的载体包含：
(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；
(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和，
(iii)编码Cas核酸酶的第三序列，
其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一引导RNA包含选自SEQIDNO:40、SEQ.IDNO.41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48或SEQIDNO:49的核苷酸序列或其各自的等同物。


3.一种用于修饰细胞中的常染色体显性疾病相关基因的方法，所述方法包括：将所述细胞与至少一种类型的编码针对所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统的载体接触，其中所述常染色体显性疾病相关基因与眼病相关，其中所述至少一种类型的载体包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与所述常染色体显性疾病相关中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；和，(ii)编码催化缺陷型Cas核酸酶(dCas)的第二序列；
其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。


4.如权利要求3所述的方法，其中所述第二引导RNA包含选自SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38或SEQIDNO:39的核苷酸序列或其各自的等同物。


5.如权利要求1或3所述的方法，其中所述细胞是诱导的多潜能干细胞(iPSC)。


6.如权利要求5所述的方法，其中所述iPSC源自受试者的成纤维细胞。


7.如权利要求5所述的方法，所述方法还包括培养所述iPSC以分化成视网膜色素上皮(RPE)细胞。


8.如权利要求7所述的方法，所述方法还包括向受试者施用所述RPE细胞。


9.如权利要求8所述的方法，其中所述RPE细胞对于所述受试者是自体的。


10.如权利要求8所述的方法，其中所述RPE细胞通过视网膜下移植来施用。


11.如权利要求1或3所述的方法，其中所述细胞对于所述SNP是杂合的。


12.如权利要求1或3所述的方法，其中所述细胞对于具有突变型等位基因和野生型等位基因的所述常染色体显性疾病相关基因是杂合的。


13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述常染色体显性疾病相关基因包含选自SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32或SEQIDNO:33的序列或其各自的等同物。


14.如权利要求1或3至13中任一项所述的方法，其中与所述常染色体显性疾病相关基因杂交的所述第一引导RNA包含SEQIDNO:31的序列。


15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶不切割或不靶向编码所述常染色体显性疾病相关基因的所述野生型等位基因。


16.一种用于治疗受试者的常染色体显性眼病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的至少一种类型的载体，所述载体编码针对所述受试者中常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统，其中所述至少一种类型的载体包含：
(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因中单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；
(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和，
(iii)编码Cas核酸酶的第三序列，
其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。


17.一种用于治疗受试者的常染色体显性眼病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的至少一种类型的载体，所述载体编码针对所述受试者中常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统，其中所述至少一种类型的载体包含：
(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；和，
(ii)编码催化缺陷型Cas核酸酶(dCas)的第二序列，
其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。


18.如权利要求16或17所述的方法，其中所述受试者对于所述SNP是杂合的。


19.如权利要求16或17所述的方法，其中所述受试者对于具有突变型等位基因和野生型等位基因的所述常染色体显性疾病相关基因是杂合的。


20.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述SNP的变体和所述突变型等位基因在同一条染色体上。


21.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述SNP存在于所述常染色体显性疾病相关基因的非编码区中。


22.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述SNP存在于所述常染色体显性疾病相关基因的转录起始位点(TSS)区域中。


23.如权利要求1或16所述的方法，其中所述Cas核酸酶是Cas切口酶。


24.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶是Cas9。


25.如权利要求3或17所述的方法，其中所述dCas与阻遏物结构域融合。


26.如权利要求25所述的方法，其中所述阻遏物结构域是Krüppel相关盒(KRAB)结构域。


27.如权利要求3或17所述的方法，其中所述第一引导RNA包含至少一个PUF(PumiliomRNA结合因子)结合序列。


28.如权利要求27所述的方法，其中所述至少一个PUF结合序列与PUF-KRAB结合。


29.如权利要求1、3、16或17中任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：WH·吴，YT·蔡，S·H·曾，
申请(专利权)人：纽约市哥伦比亚大学理事会，
类型：发明
国别省市：美国;US