【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术提供了重组工程化的去泛素化酶（dub）和用于治疗或缓解受试者中的遗传性离子通道病，例如长qt综合征、brugada综合征或囊性纤维化的方法等。本文还提供了用于从导致这类遗传性离子通道病的突变中筛选出可通过上文公开的重组工程化的dub治疗的运输缺陷突变的方法。
技术介绍
0、专利技术背景
1、包括离子通道、转运体和受体在内的整合表面膜蛋白对所有细胞的生存和功能至关重要。因此，控制膜蛋白的表面丰度和组成的过程是细胞生物学和生理学的关键决定因素。膜蛋白的表面运输受损是从囊性纤维化到心律失常的多种疾病的基础（gelman &kopito, 2002；anderson等人，2014），激发了对更好地理解控制膜蛋白表面密度的基本机制的需求。膜蛋白的表面储库受多层成熟和运输过程的调控；从内质网（er）中的适当折叠开始，在高尔基体中翻译后成熟，递送到表面并在表面持续优化，并且最终在溶酶体中将其去除和降解（macgurn等人，2012；foot等人，2017）。对控制膜蛋白命运的这些不同方面的机制的基本了解是一个重要且大量研究的研究领域。
2、泛素化是一种强大的机制，能够通过调控膜蛋白生命周期中的多个步骤来调整膜蛋白的功能性表达。泛素是76个残基的蛋白质，可以通过三种酶的顺序作用与多肽底物上的赖氨酸残基共价附着：泛素激活酶（e1）；泛素缀合酶（e2）；和泛素连接酶（e3），其催化泛素向底物的转移。人类基因组编码2种e1、37种e2和> 600种e3泛素连接酶。泛素包含7个赖氨酸残基（k6
3、去泛素化酶（dub）是特化的异肽酶（isopeptidase），其通过修饰和去除泛素链为泛素信号传导提供突出性质。有超过100种人dub，包括6个不同的家族：1）泛素特异性蛋白酶（usp）家族，2）卵巢肿瘤蛋白酶（out）家族，3）泛素c末端水解酶（uch）家族，4）约瑟芬结构域家族（josephin），5）包含与泛素相互作用的基序的新型dub家族（mindy），以及6）jab1/mpn/mov34金属酶结构域家族（jamm）。值得注意的是，usp家族是相对混杂的，水解所有泛素连接，与otu家族形成鲜明对比，otu家族包含具有不同连接偏好的多组酶。连接特异性dub最近已经纯化并用于无细胞体外测定法，作为在western印迹上运行靶蛋白质之前诊断链特异性的方式。此外，纯化的连接特异性dub已用于蚀刻（sculpt）更多的非典型泛素链以用于分离和结构分析。
4、遗传性离子通道病是罕见疾病，涵盖神经系统（癫痫、偏头痛、神经性疼痛）、心血管系统（长qt综合征、brugada综合征）、呼吸系统（囊性纤维化）、内分泌系统（糖尿病、高胰岛素血性低血糖症）和泌尿系统（bartter综合征、尿崩症）中的广泛病症。下一代基因组测序领域的快速扩展领域已经揭示了数千种具有多种潜在机制的通道突变。了解功能丧失的根本原因对于采用个性化策略治疗每种疾病至关重要。这些大量的遗传性突变导致通道在运输至表面膜方面存在缺陷。例如，囊性纤维化是高加索人最常见的致命遗传病，它是由于囊性纤维化跨膜转导调节子（cftr）（一种氯离子通道）的缺陷引起的。研究最多的突变（δf508）占所有病例的〜85%，并引起通道错误折叠和泛素依赖性运输缺陷。在长qt综合征的情况中，两个通道（kcnq1、herg）中的500多个突变占所有遗传性病例的近90%。这两个通道中的运输缺陷是大多数致病突变的机制基础。建立一个高通量筛选此类致病突变以诊断潜在病理机制的平台将是有益的。这种诊断能力将为特定突变的最佳治疗选择提供信息，从而为这些罕见疾病开发个性化药物。本文提供的专利技术涉及这样的平台。此外，本专利技术还为基因疗法和靶向纠正发现的泛素依赖性运输缺陷提供了新的治疗机会。
5、此外，最近的埃博拉疫情和耐药性“超级细菌”的出现揭示出越来越需要快速、可推广的方法来控制和限制感染的传播。传染性病原体利用宿主细胞的泛素化过程来传播和扩散疾病。特别是，已经显示病毒在其生命周期的每个方面利用泛素：病毒进入，复制和出芽。跨病毒家族中，许多病毒含有带有py基序的蛋白质，其允许募集宿主泛素e3连接酶。本专利技术利用这一保守机制提供了可推广的方法，从而选择性地靶向不同的感染过程。实际上，本专利技术能够对抗病毒对维持感染所需的泛素化的依赖，并提供了模块化的和可转移的方法来对抗新出现的、危及生命的和/或慢性感染。
技术实现思路
0、专利技术概述
1、本专利技术提供了重组工程化的去泛素化酶（dub），其包含：
2、a）催化单元；
3、b）蛋白结合子；和
4、c）所述催化单元与所述蛋白结合子之间的可变接头。
5、本专利技术还提供了在受试者中治疗或缓解遗传性离子通道病的作用的方法，其包括向所述受试者施用编码上述重组工程化的dub的核酸。
6、本专利技术还提供了从导致遗传性离子通道病的突变中筛选出可通过上述重组工程化的dub治疗的运输缺陷突变的方法，其包括以下步骤:
7、a）在表达导致遗传性离子通道病的突变的细胞中，测量突变体通道的表面密度和/或总表达；
8、b）如果该突变体通道的表面密度和/或总表达相对于野生型（wt）通道降低，则测定该突变体通道的泛素化状态；
9、c）基于该突变体通道的泛素化状态，选择上述重组工程化的dub并使其与该突变共表达，然后测量在具有共表达的细胞中突变体通道的表面密度和/或总表达；和
10、d）如果步骤（c）中突变体通道的表面密度和/或总表达相对于wt通道恢复了，则将该突变鉴定为可治疗的。
11、本专利技术还提供了在受试者中治疗或缓解急性/慢性病毒感染的作用的方法，其包括向该受试者施用编码上述重组工程化的dub的核酸。
12、本专利技术还提供了重组表达载体，其包含编码上述重组工程化的dub的核酸，并且还提供了用所述载体转化的细胞。
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1.一种重组工程化的去泛素化酶（DUB），其包含：
2.权利要求1的重组工程化的DUB，其中所述催化单元是选择性的或非选择性的。
3.权利要求1的重组工程化的DUB，其中所述催化单元包含选自以下的去泛素化酶的催化结构域：泛素特异性蛋白酶（USP）家族、卵巢肿瘤蛋白酶（OTU）家族、泛素C末端水解酶（UCH）家族、约瑟芬结构域家族（Josephin）、含有与泛素相互作用的基序的新型DUB家族（MINDY）和JAB1/MPN/Mov34金属酶结构域家族（JAMM）。
4.权利要求3的重组工程化的DUB，其中所述催化单元包含来自USP家族的去泛素化酶的催化结构域。
5.权利要求4的重组工程化的DUB，其中所述催化单元包含USP21的催化结构域。
6.权利要求3的重组工程化的DUB，其中所述催化单元包含来自OTU家族的去泛素化酶的催化结构域。
7.权利要求6的重组工程化的DUB，其中所述催化单元包含OTUD1的催化结构域。
8.权利要求6的重组工程化的DUB，其中所述催化单元包含OTUD4的催化结构域。<...
【技术特征摘要】
1.一种重组工程化的去泛素化酶（dub），其包含：
2.权利要求1的重组工程化的dub，其中所述催化单元是选择性的或非选择性的。
3.权利要求1的重组工程化的dub，其中所述催化单元包含选自以下的去泛素化酶的催化结构域：泛素特异性蛋白酶（usp）家族、卵巢肿瘤蛋白酶（otu）家族、泛素c末端水解酶（uch）家族、约瑟芬结构域家族（josephin）、含有与泛素相互作用的基序的新型dub家族（mindy）和jab1/mpn/mov34金属酶结构域家族（jamm）。
4.权利要求3的重组工程化的dub，其中所述催化单元包含来自usp家族的去泛素化酶的催化结构域。
5.权利要求4的重组工程化的dub，其中所述催化单元包含usp21的催化结构域。
6.权利要求3的重组工程化的dub，其中所述催化单元包含来自otu家族的去泛素化酶的催化结构域。
7.权利要求6的重组工程化的dub，其中所述催化单元包含otud1的催化结构域。
8.权利要求6的重组工程化的dub，其中所述催化单元包含otud4的催化结构域。
9.权利要求6的重组工程化的dub，其中所述催化单元包含cezanne的催化结构域。
10.权利要求6的重组工程化的dub，其中所述催化单元包含trabid的催化结构域。
11.权利要求6的重组工程化的dub，其中所述催化单元包含otulin的催化结构域。
12.权利要求1的重组工程化的dub，其中所述蛋白质结合子选自细胞内抗体片段、scfv、纳米抗体、抗体模拟物、单抗体、darpin、脂质运载蛋白和靶向序列。
13.权利要求12的重组工程化的dub，其中所述蛋白质结合子是vhh4纳米抗体。
14.权利要求1的重组工程化的dub，其中所述催化单元是usp21的催化结构域，且所述蛋白质结合子是vhh4纳米抗体，并且所得的重组工程化的去泛素化酶（nanousp21）能够非选择性地消除所有连接类型。
15.权利要求1的重组工程化的dub，其中所述催化单元是otud1的催化结构域，且所述蛋白质结合子是vhh4纳米抗体，并且所得的重组工程化的去泛素化酶（nanootud1）能够选择性地消除k63连接。
16.权利要求1的重组工程化的dub，其中所述催化单元是otud4的催化结构域，且所述蛋白质结合子是vhh4纳米抗体，并且所得的重组工程化的去泛素化酶（nanootud4）能够选择性地消除k48连接。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：H·M·科莱克拉夫特，S·坎纳，
申请(专利权)人：纽约市哥伦比亚大学理事会，
类型：发明
国别省市：
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