铜绿假单胞菌EZ-35、其代谢产物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株铜绿假单胞菌EZ‑35、其代谢产物及其应用，旨在解决现有技术中水稻纹枯病防治效果欠佳的技术难题。本发明专利技术铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CGMCC NO.20621能够有效抑制立枯丝核菌，可以用来防治和治疗由立枯丝核菌引起的植物病害，从而达到减少农药施用的目的，确保农业可持续性发展，具有广阔的应用前景；本发明专利技术铜绿假单胞菌能够代谢分泌大量的挥发性物质3‑甲基丁酸，且3‑甲基丁酸具有良好的抑制立枯丝核菌的作用。

【技术实现步骤摘要】
铜绿假单胞菌EZ-35、其代谢产物及其应用
本专利技术涉及生物防治
，具体涉及铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）EZ-35、其代谢产物及其应用。
技术介绍
水稻纹枯病是由立枯丝核菌侵染所引起的、发生在水稻上的病害，是影响水稻生产的三大主要病害之一，在水稻整个生育期内均可发生，但以孕穗至灌浆期发病对水稻产量的影响最大。植株发病后，轻者可造成叶鞘和叶片提早枯死，影响谷粒灌浆，形成大量秕谷，重者可使水稻不能正常抽穗，甚至整株腐烂枯死，严重影响水稻产量，使水稻结实率下降，千粒重减轻，秕谷增多。一般减产15%～20%，重病田可达60%～70%。而目前尚未发现对纹枯病有良好抗性的水稻品种。因而，针对此类病害需要进行有效的化学防治或生物防治。目前，水稻纹枯病的防治主要通过杀真菌的化学制剂来控制，如多年来在中国广泛使用的井岗霉素、唑醇等；但是，单一杀真菌剂的大量连续使用会增加病原体产生抗药性的风险，而且还会带来不良的环境问题。现有技术中也有多种替代的农业控制措施，例如施肥，土壤改良和农业管理等，但此类措施不仅费时费力，而且无法达到最佳防治效果。众所周知的，微生物来源的制剂以其高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性等特性被人们认为是未来化学农药的理想替代药剂。有研究表明，挥发性有机化合物（mVOC）可以调节植物面临的各种生物和非生物胁迫，有成为有害农药和杀真菌剂替代品的潜质。如内生细菌斯氏假单胞菌E25和嗜麦芽窄食单胞菌CR71可以通过释放以二硫化二甲基（DMDS）为主要物质的VOC来抑制灰葡萄孢的生长（Rojas-Solís等，2018）；枯草芽孢杆菌GB03产生的VOC可以直接抑制拟南芥灰霉菌的菌丝生长，并干扰病原真菌在疏水性叶子上的附着（Sharifietal.，2016）。但是，由于微生物的复杂多变性以及其代谢产生的mVOC数量庞大、种类繁多，尚不清楚是否有更有效的微生物菌株及其代谢mVOC能够特异性的抑制立枯丝核菌的生长。而当前亟需研究筛选出新的能特异性的抑制立枯丝核菌的微生物菌株及其制剂，能够用于水稻纹枯病病害防治，以减少化学制剂的使用，从而促进水稻产业的可持续发展。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种能够特异性的抑制立枯丝核菌生长的铜绿假单胞菌EZ-35，并根据其所分泌产物的特性，提出了应用途径，以期实现水稻纹枯病的生物防治，或提取到效果良好的抑菌活性物质。研究发现，在水稻生长过程中，根系可以释放各种信号分子以组装一个独特的根系微生物群落。这些微生物在水稻的生长发育中起着重要的作用。通过释放各种代谢物，例如植物激素和mVOC，它们不仅可以促进植物生长，还可以帮助植物抵抗各种疾病。迄今为止，很少有关于水稻相关细菌抑制立枯丝核菌生长的研究，尚无关于水稻根际细菌是否可以通过释放VOC抑制立枯丝核菌生长的报道。基于此，本专利技术人对健康水稻根际土壤进行了系列的根际微生物分离筛选研究，并从中筛选得到一株能够抑制立枯丝核菌生长的铜绿假单胞菌EZ-35，该菌株于2020年9月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏编号为CGMCCNO.20621。利用上述铜绿假单胞菌CGMCCNO.20621、其代谢产物或其液体发酵物能够制备得到水稻纹枯病生防制剂；研究发现该菌株能够分泌大量的抑菌活性物质3-甲基丁酸（3-methyl-Butanoicacid）。利用如下方法制备得到水稻纹枯病生防制剂：将铜绿假单胞菌在固体培养基上划线，30～32℃、避光培养70～72h，挑取单菌落接种到液体培养基中，30～32℃、150～180r/min、避光培养70～72h，再按常规步骤制得生防制剂。基于铜绿假单胞菌CGMCCNO.20621所具备的性质，可将其应用于水稻纹枯病防治中。利用铜绿假单胞菌CGMCCNO.20621可以制备抑菌活性物质3-甲基丁酸（3-methyl-Butanoicacid）。与现有技术相比，本专利技术的主要有益技术效果在于：1.本专利技术铜绿假单胞菌CGMCCNO.20621能够特异的抑制立枯丝核菌，可以用来防治和治疗由立枯丝核菌引起的植物病害，从而达到减少农药施用的目的，以确保农业健康可持续性发展，具有广阔的应用前景。2.本专利技术铜绿假单胞菌CGMCCNO.20621能够代谢分泌大量的挥发性物质3-甲基丁酸（3-methyl-Butanoicacid）；本专利技术还首次研究发现3-甲基丁酸（3-methyl-Butanoicacid）具有良好的抑制立枯丝核菌的作用。附图说明图1为铜绿假单胞菌抑制立枯丝核菌的效果对比照片，实验组为铜绿假单胞菌对扣熏蒸立枯丝核菌，对照组为不接种培养基对扣熏蒸立枯丝核菌。图2为铜绿假单胞菌产挥发性有机化合物的色谱图。图3为3-甲基丁酸抑制立枯丝核菌的效果对比照片；其中，A为3-甲基丁酸抑制立枯丝核菌的效果对比照片，其中，试验组滴加50uL纯品3-甲基丁酸和150uL灭菌水（25%浓度），对照组滴加200uL灭菌水；B为3-甲基丁酸抑制小孢根霉的效果对比照片，其中，试验组滴加200uL纯品3-甲基丁酸，对照组滴加200uL灭菌水。图4为3-甲基丁酸抑制立枯丝核菌侵染离体水稻叶片的效果评估对比照片。图5为不同菌株培养相同时间释放3-甲基丁酸的色谱峰面积对比图；其中，35（EZ-35）为本专利技术铜绿假单胞菌，34为神户氏肠杆菌，62为阿氏芽孢杆菌，此两株菌株均由王恩召在中国农业科学院温室的健康水稻盆栽中采集、筛选所得。具体实施方式下面结合附图和实施例来说明本专利技术的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂或产品如无特别说明，均为市售常规试剂或产品；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1：生防菌株的筛选和鉴定（1）筛选2018年12月在中国农业科学院温室由王恩召于盆栽实验中采集健康水稻根际土壤样品（从水稻去掉根部表面约5cm的覆土，按S形，随机采集水稻根系结合的松散土体）。对照组为无菌水，试验组为梯度稀释的土壤样品悬液。试验组的具体操作方法为：利用梯度稀释涂布法将逐级稀释的土壤样品的悬液涂布到牛肉膏蛋白胨平板上，挑取单菌落到液体牛肉膏蛋白胨培养基中获得菌液，取各菌液均匀涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h，将接菌的平板对扣在中心接种10uL立枯丝核菌菌液（立枯丝核菌购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：36246）的PDA平板上培养，32℃、黑暗条件下培养，并统计抑菌率，筛选具有抑菌效果的菌株。所涉及培养基的配比为：牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂18g、去离子水1L，pH7.2～7.4；液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株铜绿假单胞菌（

【技术特征摘要】
1.一株铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruqinosa）EZ-35，其保藏编号为CGMCCNO.20621。


2.一种生防制剂，含铜绿假单胞菌CGMCCNO.20621、其代谢产物、其液体发酵物中的至少一种。


3.权利要求2所述生防制剂的制备方法，包括如下步骤：
将铜绿假单胞菌CGMCCNO.20621在固体培养基上划线，30～32℃、避光培养70～72h，挑取单菌落接种到液体培养基中，30～32℃、150～180r/min、避光培养70～...

【专利技术属性】
技术研发人员：范分良，王恩召，宋阿琳，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11