银屑病性关节炎的DNA甲基化标记物、诊断试剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了银屑病性关节炎（Psoriatic Arthritis,PsA）的DNA甲基化标记物、诊断试剂及其应用。包括6个甲基化位点：chr14:38061326、chr14:38061320、chr9:128585454、chr6:37225002、chr3:101901234、chr6:97369501的一个或多个。本发明专利技术首次利用特定的DNA甲基化位点作为分子标记对银屑病性关节炎和类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）患者进行辅助筛查，为该领域的诊断开辟了新的途径和方式。本发明专利技术是利用患者全血进行DNA甲基化位点的检测，做到早期诊断PsA的目的，所需要的血标本少，方便易开展，具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
银屑病性关节炎的DNA甲基化标记物、诊断试剂及其应用
本专利技术属于医药分子生物学检测
，具体涉及银屑病性关节炎的诊断标记物、诊断试剂及其应用。
技术介绍
银屑病性关节炎（Psoriaticarthritis,PsA）是一种与银屑病相关的炎性关节病，具有银屑病皮疹并导致关节和周围软组织疼痛、肿胀、压痛、僵硬和运动障碍。部分患者可有骶髂关节炎和（或）脊柱炎，病程迁延、易复发、晚期可有关节强直，导致残废。PsA发病的高峰年龄为35-45岁，约70%的PsA患者银屑病皮损早于关节炎症出现，约15%患者皮损与关节炎症同时出现。早期PsA是指在患者确诊后1-2年内，没有疼痛症状，因此，此时仅仅依靠临床症状很难做出准确早期诊断。而这部分可能发展为PsA的患者，如果不早期干预，可能在1-2年后出现严重的、不可逆的关节损害。如果能够在PsA患者出现严重的、不可逆的关节损害前进行早期诊断，对于PsA的防治、改善患者关节症状和生活质量具有重大意义。然而，目前的诊断主要是根据患者的病史、临床表现和关节X片的改变，目前没有生物学诊断标志物对PsA患者进行早期诊断。近年来，表观遗传学标记物研究发展迅速，许多表观遗传标志物如DNA甲基化标记物、血清microRNA标记物被筛选和鉴定，这些标记物对于疾病的早期诊断和预后判断具有重要价值。我们在前期研究中发现寻常型银屑病患者呈现异常的表观遗传修饰，不难推测表观遗传修饰在银屑病性关节炎和寻常型银屑病的发生发展中起重要作用。前期研究结果也显示，寻常型银屑病人的外周血单个核细胞核皮损样本呈现DNA甲基化的异常修饰、异常的组蛋白修饰和异常升高的非编码RNA表达，这些都要说明表观遗传学调控参与了寻常型银屑病的发生发展，可能作为发病或者预后及反映活动性的标记物。
技术实现思路
本专利技术发现了用于PsA早期诊断的生物标记物，这些生物标记物包含位于不同DNA片段中的6个CpG位点，通过检测6个CpG位点的甲基化水平，联合进行Logistic二元回归和ROC曲线分析，可以早期诊断PsA，同时还能区分类风湿性关节炎（RA）。本专利技术的首要目的在于提供银屑病性关节炎的DNA甲基化标记物。包括6个甲基化位点：chr14:38061326、chr14:38061320、chr9:128585454、chr6:37225002、chr3:101901234、chr6:97369501的一个或多个。chr14:38061326（CpGID:cg07940072），chr14:38061326、chr14:38061320两者相距6个碱基，chr14:38061320是位于chr14:38061326上游6个碱基的甲基化位点；chr9:128585454（CpGID:cg15734589）；chr6:37225002（CpGID:cg12800266）；chr3:101901234（CpGID:cg12992827）；chr6:97369501（CpGID:cg24500972）。银屑病性关节炎患者6个CpG位点甲基化水平与健康对照组相比显著降低，但比类风湿性关节炎患者相比显著升高。本专利技术的第二个目的是提供上述银屑病性关节炎的DNA甲基化标记物的应用。即检测上述的6个甲基化位点中的一个或多个的甲基化水平的产品在制备诊断银屑病性关节炎制剂中的应用。所述的产品通过分析多个样本测序结果，获得至少2个CpG位点的甲基化水平，联合至少2个CpG位点的甲基化水平做二元Logistic回归分析，做出公式，用于待测样本的检测。进一步的，优选获得4个、5个或者6个甲基化位点的甲基化水平，做二元Logistic回归分析，做出公式，用于待测样本的检测。银屑病性关节炎和类风湿性关节炎相比时，一般是出现了关节炎症状，但无法确定属于哪种关节炎，选择：4个CpG位点：chr14:38061326、chr14:38061320、chr3:101901234、chr6:97369501；5个CpG位点：chr14:38061326、chr14:38061320、chr9:128585454、chr3:101901234、chr6:97369501；6个CpG位点：chr14:38061326、chr14:38061320、chr9:128585454、chr6:37225002、chr3:101901234、chr6:97369501。银屑病性关节炎和健康对照组相比时，一般用于没有出现关节炎症状时的判断，选择：4个CpG位点：chr14:38061326、chr14:38061320、chr3:101901234、chr6:97369501；5个CpG位点：chr14:38061326、chr14:38061320、chr6:37225002、chr3:101901234、chr6:97369501；6个CpG位点：chr14:38061326、chr14:38061320、chr9:128585454、chr6:37225002、chr3:101901234、chr6:97369501。进一步的，银屑病性关节炎和类风湿性关节炎相比，联合6个CpG位点的甲基化水平进行二元Logistic回归分析，得到公式Y=-0.854×A+0.530×B-0.038×C-0.012×D+0.119×E+0.156×F-8.344，其中A、B表示chr14:38061326和chr14:38061320；C表示chr9:128585454；D表示chr6:37225002；E表示chr3:101901234；F表示chr6:97369501位点的甲基化水平的数值；根据待测样本的6个CpG位点的甲基化数值，计算出相应的Y值，Y值大于-0.157，诊断为银屑病性关节炎；或者联合5个CpG位点的甲基化水平进行二元Logistic回归分析，得到公式Y=-0.850×A+0.534×B-0.036×C+0.117×E+0.144×F-8.618，其中A、B表示chr14:38061326和chr14:38061320；C表示chr9:128585454；E表示chr3:101901234；F表示chr6:97369501位点的甲基化水平的数值；根据待测样本的5个CpG位点的甲基化数值，计算出相应的Y值，Y值大于-0.1396，诊断为银屑病性关节炎。进一步的，银屑病性关节炎和健康对照组相比，联合6个CpG位点的甲基化水平进行二元Logistic回归分析，得到公式Y=-0.448×A-0.04×B+0.018×C-0.118×D-0.08×E-0.015×F+15.892；其中A、B表示chr14:38061326和chr14:38061320；C表示chr9:128585454；D表示chr6:37225002；E表示chr3:101901234；F表示chr6:97369501位点的甲基化水平的数值；根据待测样本的6个Cp本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.银屑病性关节炎的DNA甲基化标记物，其特征在于，包括6个甲基化位点：chr14:38061326、chr14:38061320、chr9:128585454、chr6:37225002、chr3:101901234、chr6:97369501的一个或多个。/n

【技术特征摘要】
1.银屑病性关节炎的DNA甲基化标记物，其特征在于，包括6个甲基化位点：chr14:38061326、chr14:38061320、chr9:128585454、chr6:37225002、chr3:101901234、chr6:97369501的一个或多个。


2.根据权利要求1所述的银屑病性关节炎的DNA甲基化标记物，其特征在于，银屑病性关节炎患者6个CpG位点甲基化水平与类风湿性关节炎患者相比显著升高。


3.根据权利要求1所述的银屑病性关节炎的DNA甲基化标记物，其特征在于，银屑病性关节炎患者6个CpG位点甲基化水平与健康对照组相比显著降低。


4.检测权利要求1所述的6个甲基化位点中的一个或多个的甲基化水平的产品在制备诊断银屑病性关节炎制剂中的应用。


5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的产品包括PCR试剂和焦磷酸测序试剂。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的PCR试剂采用的引物对如下：
扩增含chr14:38061326和chr14:38061320位点的引物：
F1：GGGTGTAGAGTTTAGTAGGAGTT
R1：AATCATAAACCTCTTCCCCTATT
扩增含chr9:128585454位点的引物：
F1：TAGTTGTGGGAAAAGTGGAGAA
R1：CCTCACAAAATCATAACAACTTTTATT
扩增含chr6:37225002位点的引物：
F1：ATGGATTGATATAGGGATTAGATTATTTGA
R1：ATTATTACCCTCCTTTCCTCATTC
扩增含chr3:101901234位点的引物：
F1：GGAGATTAGTTTGGTGAAAATGATAT
R1：ACCTATTAACCCAACCACTAAATT
扩增含chr6:97369501位点的引物：
F1：AGAAATATGGTTTAGTGATTTTTTAATGT
R1：AATTCTTTATTCAATTCCTAATAACTACC。


7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的产品通过分析多个样本测序结果，获得至少2个CpG位点的甲基化水平，联合至少2个CpG位点的甲基化水平做二元Logistic回归分析，做出公式，用于待测样本的检测。


8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，银屑病性关节炎和类风湿性关节炎相比，联合6个CpG位点的甲基化水平进行二元Logistic回归分析，得到公式Y=-0.854×A+0.530×B-0.038×C-0.012×D+0.119×E+0.156×F-8.344，其中A、B表示chr14:38061326和chr14:38061320；C表示chr9:128585454；D表示chr6:37225002；E表示chr3:101901234；F表示chr6:97369501位点的甲基化水平的数值；根据待测样本的6个CpG位点的甲基化数值，计算出相应的Y值，Y值大于-0.157，诊断为银屑病性关节炎；
或者联合5个CpG位点的甲基化水平进行二元Logistic回归分析，得到公式Y=-0.850×A+0.534×B-0.036×C+0.117×E+0.144×F-8.618，其中A、B表示chr14:38061326和chr14:38061320；C表示chr9:128585454；E表示chr3:101901234；F表示chr6:97369501位点的甲基化水平的数值；根据待测样本的5个CpG位点的甲基化数值，计算出相应的Y值，Y值大于-0.1396，诊断为银屑病性关节炎。


9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，银屑病性关节炎和健康对照组相比，联合6个CpG位点的甲基化水平进行二元Logistic回归分析，得到公式Y=-0.448×A-0.04×B+0.018×C-0.118×D-0.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆前进，赵明，苏玉文，邓敏，吴海竞，
申请(专利权)人：中南大学湘雅二医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43