一种高效紫萍遗传转化技术制造技术

本发明专利技术公开了一种高效紫萍遗传转化技术，包括如下步骤：1）紫萍愈伤组织诱导；2）愈伤组织生长；3）农杆菌侵染后共培养；4）.愈伤组织分化培养：

【技术实现步骤摘要】
一种高效紫萍遗传转化技术


[0001]本专利技术涉及植物愈伤组织再生的技术，特别是一种高效紫萍遗传转化技术。

技术介绍

[0002]紫萍（Spirodela polyrhiza）是浮萍科（1emnaceae）多根紫萍属（Spirodela）水生漂浮植物，是最小的开花植物之一。紫萍个体小、结构简单，仅由叶状体和根系组成；无性繁殖速度快，2~3 天可增殖一代。浮萍家族中只有紫萍完成了全基因组测序，紫萍作为植物表达系统具有潜在的研究和应用价值。
[0003]从进化关系上来说，紫萍是浮萍科中最原始的类型，其基因组也比其他浮萍科植物小，并且具有最紧凑的单子叶植物线粒体基因组，也是浮萍家族中唯一完成全基因组测序工作的品系(Accession:PRJN A46611)，紫萍的线粒体基因组也完成了测序工作，遗传背景清晰，有利于后续分子水平的研究工作。相较于青萍属，紫萍属不存在种内变异的情况，遗传相对稳定。紫萍进行大量培养时，其个体小、整个植株漂浮于水面，易于捕捞进行数量控制。紫萍在植物生理学、遗传学、生态学等领域已在国内外展开了广泛研究，多应用于水体污染修复生物质能源利用等方面。
[0004] 近年来，浮萍科38个亚种中，受基因型的影响，只有6个种（Spirodela oligorrhiza、Lemna gibba、Lemna minor、Landoltia punctata、Wolffia arrhiza、Wolffia globos）建立了稳定的再生体系和遗传转化体系，且它们间的再生体系和遗传转化体系条件千差万别，已发展成为一个较好的植物表达系统，在生物制药方面表现出巨大的潜力。目前已成功商业化的两种浮萍表达体系是Lemna minor和Landoltia punctata，且与浮萍蛋白表达体系相关的所有专利技术都为美国Synthon公司拥有，我国若想在这一领域有所突破，将只能从紫萍、无根萍和扁无根萍着手。并且中国目前缺乏自主知识产权的植物表达系统，国家科技部科技规划中建立和发展植物高效表达系统是重点研究领域，紫萍作为植物表达系统具有产量高、成本低、安全性、用途广、受益大这五大潜在优势。
[0005]专利技术以紫萍叶状体愈伤组织作为外植体，建立农杆菌介导的紫萍高效遗传转化体系，为浮萍植物转基因表达系统的建立提供强有力技术支撑。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是克服现有技术中尚无紫萍蛋白表达体系的技术缺陷，提供一种高效紫萍遗传转化技术。
[0007]为实现上述技术目的，本专利技术提供的一种高效紫萍遗传转化技术，其特征在于包括如下步骤：1）.紫萍愈伤组织诱导；2）.愈伤组织生长：获得的紫萍愈伤组织置于愈伤组织生长培养基中，所述愈伤组织生长培养基为基本培养基I+2 mg/L 2,4-D+质量百分比1 % 山梨醇+ 质量百分比0.8 % 琼脂+质量百分比3 %蔗糖，生长1周后，作为农杆菌的侵染外植体；
3）.农杆菌侵染后共培养：将OD
600
（0.3～0.5）农杆菌菌株与紫萍愈伤组织混合，抽真空时长为13 min，压力1kg/cm2，侵染后的紫萍愈伤组织在愈伤组织生长培养基中暗培养共培养 3 天，每天在26 ℃保持16h、24 ℃保持8h；4）.愈伤组织分化培养：
①
看护培养条件下选择培养：侵染后的愈伤组织在选择培养基中看护培养，所述选择培养基为超纯水+质量百分比0.8 % 琼脂+200 mg/L头孢霉素+30 mg/L潮霉素B ，在此看护培养中，光照下进行选择培养1周；
②
ZT分化培养：选择培养后的紫萍愈伤组织在ZT分化培养基中，所述ZT分化培养基中为基本培养基II+2 mg/L ZT+ 质量百分比0.15 % 植物凝胶Phytagel +质量百分比0.4 % 琼脂+200 mg/L头孢霉素+30 mg/L潮霉素B ，光照条件下，每2周继代一次，3周后形成转基因紫萍叶状体；5.紫萍叶状体扩培培养：
①
固体扩培：转基因紫萍叶状体在固体扩培培养基中扩培，所述固体扩培培养基为基本培养基II+30 mg/L潮霉素B + 质量百分比0.15 % 植物凝胶 Phytagel +质量百分比 0.4 % 琼脂+质量百分比3 % 蔗糖，光照条件下扩培筛选，第4天紫萍叶状体自愈生长出幼根，继续培养3天后将再生紫萍单叶片“克隆”的再生转基因紫萍叶状体分别继代至液体扩培培养基中；
②
液体扩培：上述再生转基因紫萍叶状体在液体扩培培养基中扩培，所述液体扩培培养基为基本培养基III+30 mg/L潮霉素B +质量百分比1.2 % 蔗糖，连续培养 5-7天，生长旺盛的叶状体即为表达量高的再生转基因紫萍叶状体，每隔5-7天，将再生转基因紫萍叶状体在液体扩培培养基中，光照条件下继代扩大培养一次，1周后即可获得转基因植株；以上各步骤中，所述光照条件均为：光照16h/黑暗8h，光照温度26℃/黑暗温度24℃、光照强度70-80 μmol photons/m
2 /s；在所述基本培养基I中，成分组成及各成分含量为在专利ZL201410534187.3中所述的紫萍诱导培养基的基础上，不含激素成分、固化剂和碳源；在所述基本培养基II中，成分组成及各成分含量为： a).大量元素，其中含有2200 mg/L KNO3、270 mg/L NH4HPO4、350 mg/L MgSO4·
7H2O、160 mg/L CaCl2·
2H2O；b).微量元素，其中含有15 mg/L MnSO4·
4H2O、7.5 mg/L ZnSO4·
7H2O、6.0 mg/L H3BO3、0.8 mg/L KCl、0.25 mg/L Na2MoO4·
7H2O、0.025 mg/L CuSO4·
5H2O4、0.025 mg/L CoCl2·
6H2O；c).铁盐，其中含有3.7 mg/L Na
2-EDTA
·
2H2O和2.3 mg/L FeSO4.7H2O；d).有机物，其中含有1.2 mg/L甘氨酸、0.2 mg/L盐酸吡哆醇、0.05 mg/L盐酸硫铵素、0.2 mg/L烟酸、30 mg/L肌醇；所述基本培养基III与专利ZL201410534187.3中所述的紫萍生根培养基相同。
[0008]本专利技术的有益效果是：
①
.转化效率高，方法简单易操作：以紫萍叶状体脱分化形成的愈伤组织作为工程农杆菌的侵染对象，采取抽真空法，侵染效率高，愈伤组织侵染成功阳性率达100 %，愈伤组织分化率达51.3 %，转基因植株生根率100 %；
②
.转基因植株再生时间短：从愈伤组织的获得、农杆菌侵染愈伤组织、农杆菌和愈伤组织共培养、愈伤组织分化为叶状体、叶状体再生根等阶段，转基因紫萍再生的时间为11-12周；
③
转基因植株遗传稳定；
④
产量高、成本低、安全性高、用途广、受益大。
附图说明
[0009]图1为愈伤组织侵染共培养3天本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效紫萍遗传转化技术，其特征在于包括如下步骤：1）.紫萍愈伤组织诱导；2）.愈伤组织生长：获得的紫萍愈伤组织置于愈伤组织生长培养基中，所述愈伤组织生长培养基为基本培养基I+2 mg/L 2,4-D+质量百分比1 % 山梨醇+ 质量百分比0.8 % 琼脂+质量百分比3 %蔗糖，生长1周后，作为农杆菌的侵染外植体；3）.农杆菌侵染后共培养：将OD
600 （0.3～0.5） 农杆菌菌株与紫萍愈伤组织混合，抽真空时长为13 min，压力1kg/cm
2 ，侵染后的紫萍愈伤组织在共培养基中暗培养共培养 3 天，所述共培养基中为基本培养基I+2 mg/L 2, 4-D+质量百分比1 %山梨醇+质量百分比 0.8 % 琼脂，每天在26 ℃ 保持16h、24 ℃保持8h；4）.愈伤组织分化培养：
①
看护培养条件下选择培养：侵染后的愈伤组织在选择培养基中看护培养，所述选择培养基为超纯水+质量百分比0.8 % 琼脂+200 mg/L头孢霉素+30 mg/L潮霉素B ，在此看护培养中，光照下进行选择培养1周；
②
ZT分化培养：选择培养后的紫萍愈伤组织在ZT分化培养基中，所述ZT分化培养基中为基本培养基II+2 mg/L ZT+ 质量百分比0.15 % 植物凝胶Phytagel +质量百分比0.4 % 琼脂+200 mg/L头孢霉素+30 mg/L潮霉素B ，光照条件下，每2周继代一次，3周后形成转基因紫萍叶状体；5）.紫萍叶状体扩培培养：
①
固体扩培：转基因紫萍叶状体在固体扩培培养基中扩培，所述固体扩培培养基为基本培养基II+30 mg/L潮霉素B + 质量百分比0.15 % 植物凝胶 Phytagel +质量百分比 0.4 % 琼脂+质量百分比3 % 蔗糖，光照条件下扩培筛选，第4天紫萍叶状体自愈生长出幼根，继续培养3天后将再生紫萍单叶片“克隆”的再生转基因紫萍叶状体分别继代至...

【专利技术属性】
技术研发人员：王友如，张丽，艾薇，黄蓉，李玲，
申请(专利权)人：湖北师范大学，
类型：发明
国别省市：