CRISPR/Cas12a基因编辑系统在84K杨树基因编辑中的应用技术方案

本发明专利技术涉及一种CRISPR/Cas12a基因编辑系统在84K杨树基因编辑中的应用，属于植物基因工程技术领域。包括PagPDS基因靶位点的选择；载体的构建；杨树的遗传转化；转基因植株的获得；CRISPR系统对杨树基因的定向编辑情况分析。本发明专利技术的CRISPR/Cas12a基因编辑系统在84K杨树基因编辑中的应用，使用杂种杨

【技术实现步骤摘要】
CRISPR/Cas12a基因编辑系统在84K杨树基因编辑中的应用


[0001]本专利技术涉及CRISPR/Cas12a基因编辑系统在木本植物基因编辑中的应用，特别涉及 CRISPR/Cas12a基因编辑系统在84K杨树基因编辑中的应用，属于生物基因工程


技术介绍

[0002]木本植物寿命长，基因组高度杂合，具有多年生次生生长过程及木材形成的特征。木本植物由于基因编辑工具的限制，很难通过突变体来研究基因功能，例如创建大量单基因或多基因缺失的突变体。
[0003]杨树是木本植物中的模式植物，它是纸张、木材、建筑材料以及生物燃料的重要来源，具有很高的经济和生态价值。对于研究者来说，杨树是研究多年生次生维管形成层活性、木材形成以及研究次生细胞壁的理想材料。
[0004]近年来，CRISPR/Cas9基因组编辑系统已成功应用于杨树中，但尚未见Cas12a在杨树中的报道。Cas12a来自普氏菌属(Prevotella)和弗朗西丝菌属(Francisella)，是一种新型的Cas核酸内切酶，已被用作多种植物物种的基因编辑系统，例如拟南芥、水稻、棉花、烟草、大豆。Cas12a蛋白结构简单，分子量较小，其介导的基因编辑无需trancrRNA，只需一个较短的单链crRNA。Cas12a识别PAM序列为3
‘
端T富含区域(SpCas9对应PAM序列为 5
’-
NGG-3
’
)，因此，Cas12a介导的基因组编辑不仅可以扩大除CRISPR/Cas9之外的靶标，还可以产生交错的切割，可以对编辑基因位点产生高效率的编辑效果，引入不同程度的碱基序列的插入或者缺失突变。
[0005]因此，如何将CRISPR/Cas12a基因编辑系统在木本植物84K杨树基因编辑研究中建立并高效率的应用，就成为该
急需解决的技术难题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的之一是，针对现有技术中存在的不足，提供一种简单、有效的 CRISPR/Cas12a基因编辑系统在84K杨树基因编辑中的应用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：
[0008]CRISPR/Cas12a基因组编辑系统在84K杨树基因编辑中的应用，其步骤如下：
[0009]步骤(1)：84K杨树八氢番茄红素脱氢酶基因8靶位点的选择
[0010]根据CTAB方法，提取野生型杨树
‘
84K
’
基因DNA，从提取的杨树
‘
84K
’
基因DNA中克隆八氢番茄红素脱氢酶基因8(PagPDS基因)；
[0011]用序列表中序列3所示特异性引物序列F和序列表中序列4所示特异性引物序列R，扩增PagPDS；PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳；使用TIANgel Midi纯化试剂盒回收 DNA，并将其克隆到pMD18-T Simple载体中；
[0012]根据序列，排除SNP位点，根据GC含量和PAM序列(FnCas12a，PAM 5
′-
TTN-3
′
； AsCas12a，PAM 5
′-
TTTN-3
′
；LbCas12a，PAM 5
′-
TTTN-3
′
)，设计5个sgRNA靶向基因内的位
点；
[0013]步骤(2)：载体的构建
[0014]将5个gRNA即gRNA1、gRNA2、gRNA3、gRNA4、gRNA5，见序列9-13，与 tRNA
–
crRNA串联在一起组成crRNA盒，包括一个成熟的直接重复(DR序列 TAATTTCTACTAAGTGTAGAT)和24bp的gRNA序列，并由拟南芥RNA聚合酶III启动子AtU6-26驱动的crRNA盒，pCambia1300二元载体中的2x35S启动子驱动三种不同来源的核酸内切酶AsCas12a、LbCas12a和FnCas12a，构建的载体分别命名为 PagPDS-AsCas12a、PagPDS-LbCas12a和PagPDS-FnCas12a；
[0015]步骤(3)：杨树的遗传转化
[0016]通过电击法，将步骤(2)构建好的三个表达载体分别转入农杆菌GV3101中，通过农杆菌介导将载体转入杨树，转化步骤如下：用于遗传转化的杂交杨克隆84K组培苗在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为50μMm-2s-1的条件下培养；
[0017]含有载体的农杆菌在OD600＝0.6～0.8时侵染84K叶盘，感染后的叶盘在不定芽诱导培养基(SIM，Murashige-Skoog(MS)基本培养基添加0.5mg/l 6-benzyl aminopurine(6-BA， 6-苄基氨基嘌呤)和0.05mg/l naphthaleneacetic acid(NAA，萘乙酸))上，在温度为22
±
2℃的黑暗条件下共培养3天，共培养后的叶盘转移至含有3mg/L hygromycin B(潮霉素B) 和200mg/L Timentin(特美汀)的SIM上，在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/ 黑夜)、光照强度为50μMm-2s-1的条件下诱导和筛选抗性不定芽，经过约30天的诱导培养，将抗性不定芽转移至含有3mg/L hygromycin B和200mg/LTimentin的生根培养基中 (RIM，1/2MS基本培养基添加0.05mg/L IBA和0.02mg/L NAA)，直至诱导出不定根，提取已生根植株叶片DNA，PCR验证；
[0018]步骤(4)：转基因植株的获得
[0019]PagPDS-AsCas12a、PagPDS-FnCas12a和PagPDS-LbCas12a通过农杆菌转化叶盘法分别获得抗性筛选阳性的转基因植株30棵，PDS的双等位基因纯合和杂合突变体均表现出白化表型。
[0020]优选地，在步骤(4)之后，增加下述步骤(5)：
[0021]步骤(5)：温度处理(热处理)
[0022]为进一步提高Cas12a的编辑效率，本专利技术人对农杆菌侵染后培养的愈伤(农杆菌侵染后的组织在含有抗生素和筛选剂的培养基上室温暗培养下约一个半月即可长出愈伤组织) 进行热处理。
[0023]优选地，所述步骤(5)具体如下：
[0024]首先，转化材料黑暗共培养2天，清洗农杆菌，材料转移至诱导愈伤培养基中，黑暗、室温(22℃)诱导愈伤4周，然后，愈伤进行28℃热处理，28℃培养30h转移到22℃培养42h，重复4次后，放置室温下正常培养，材料转移至诱导出芽培养基中诱导出芽，记录形态和分子表型。
[0025]步骤(6)：CRISPR系统对杨树基因的定向编辑情况分析
[0026]为了分析转基因T0代中PagPDS的突变情况，使用CTAB方法，从稳定的转基因植物和野生型植物中提取基因组DNA，用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CRISPR/Cas12a基因编辑系统在84K杨树基因编辑中的应用，其步骤如下：步骤(1)：84K杨树八氢番茄红素脱氢酶基因8靶位点的选择根据CTAB方法，提取野生型杨树
‘
84K
’
基因DNA，从提取的杨树
‘
84K
’
基因DNA中克隆八氢番茄红素脱氢酶基因8；用特异性引物F和特异性引物R，扩增PagPDS；PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳；使用TIANgel Midi纯化试剂盒回收DNA，并将其克隆到pMD18-T Simple载体中；步骤(2)：载体的构建根据NGG设计原则，设计5个gRNA，即gRNA1、gRNA2、gRNA3、gRNA4、gRNA5，将5个gRNA与tRNA
–
crRNA串联在一起，每个单位包括一个成熟的直接重复和24bp的引导序列，并由拟南芥RNA聚合酶III启动子AtU6-26驱动的多个crRNA盒，pCambia1300二元载体中的2x35S启动子驱动AsCas12a、LbCas12a和FnCas12a，在AsCas12a、LbCas12a或FnCas12a上进行编辑，构建的载体分别命名为PagPDS-AsCas12a、PagPDS-LbCas12a和PagPDS-FnCas12a；步骤(3)：杨树的遗传转化通过电击法，表达载体转入农杆菌GV3101中，通过农杆菌介导将载体转入杨树，转化步骤如下：用于遗传转化的杂交杨克隆84K组培苗在培养温度为23-25℃、光照为16/8h、光照强度为50μMm-2s-1的条件下培养；含有载体的农杆菌在OD600＝0.6～0.8时侵染84K叶盘，感染后的叶盘在不定芽诱导培养基上，在温度为22
±
2℃的黑暗条件下共培养3天，共培养后的叶盘转移至含有3mg/L hygromycin B和200mg/L Timentin的SIM上，在培养温度为23-25℃、光照为16/8h、光照强度为50μMm-2s-1的条件下诱导和筛选抗性不定芽，经过约30天的诱导培养，将抗性不定芽转移至含有3mg/L hygromycin B和200mg/LTimentin的生根培养基中，直至诱导出不定根，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜娟，王瑶，安轶，卢孟柱，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：