一种采用本氏烟作为生物反应器制备的轮状病毒疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种采用本氏烟作为生物反应器制备的轮状病毒疫苗及其制备方法和应用。本发明专利技术提供了一种制备P2

【技术实现步骤摘要】
一种采用本氏烟作为生物反应器制备的轮状病毒疫苗及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种采用本氏烟作为生物反应器制备的轮状病毒疫苗及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]以植物为生物反应器生产人和动物疫苗，是一种正在极速发展的新型生物技术体系。与鸡胚、动物细胞、昆虫细胞体系相比，因其不被动物病原感染的特征，具备很高的生物安全性。植物易于培养和不需无菌操作等特征，使植物产品具备成本低、周期短、易于扩大规模等优势。
[0003]轮状病毒(Rotavirus)是引起婴幼儿重症腹泻的主要病因，每年造成约几十万病例婴幼儿死亡，接种疫苗是唯一有效的防控手段。通过两剂以上的免疫程序可获得持久性保护，避免重症腹泻的发生。目前上市的RV疫苗均为口服减毒活疫苗，因其潜在的肠套叠风险，被WHO列为“工艺需要改进的疫苗”。亚单位疫苗由病毒的主要抗原组成并通过注射接种，能有效避免肠套叠的发生。同时亚单位疫苗能实现对流行毒株的精准免疫，应对轮状病毒的变异。
[0004]轮状病毒主要的中和抗原为VP7(G蛋白)和VP4(P蛋白)，VP4在消化道被胰蛋白酶裂解为VP5*和VP8*两个片段，其中VP8*亚单位是病毒粒子识别宿主细胞的位点，在不同毒株之间变化很大，是实现精准免疫的主要抗原之一。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种采用本氏烟作为生物反应器制备的轮状病毒疫苗及其制备方法和应用。
[0006]本专利技术提供了一种制备P2
-△
VP8*蛋白的方法，包括如下步骤：
[0007](1)将重组农杆菌甲侵染本生烟植株，培养植株；
[0008](2)取植株被侵染的组织，提取总蛋白；
[0009](3)从总蛋白中纯化得到P2
-△
VP8*蛋白。
[0010]本专利技术还提供了一种制备P2
-△
VP8*蛋白的方法，包括如下步骤：
[0011](1)将重组农杆菌甲和重组农杆菌乙共侵染本生烟植株，培养植株；
[0012](2)取植株被侵染的组织，提取总蛋白；
[0013](3)从总蛋白中纯化得到P2
-△
VP8*蛋白。
[0014]本专利技术还提供了一种制备P2
-△
VP8*蛋白的方法，包括如下步骤：
[0015]采用本生烟植株作为生物反应器，植株叶片被注射重组农杆菌甲，然后培养4-7天，然后取所述叶片提取总蛋白，然后从总蛋白中纯化得到P2
-△
VP8*蛋白。
[0016]本专利技术还提供了一种制备P2
-△
VP8*蛋白的方法，包括如下步骤：
[0017]采用本生烟植株作为生物反应器，植株叶片被注射重组农杆菌甲和重组农杆菌
乙，然后培养4-7天，然后取所述叶片提取总蛋白，然后从总蛋白中纯化得到P2
-△
VP8*蛋白。
[0018]以上任一所述P2
-△
VP8*蛋白为如下(a1)或(a2)：
[0019](a1)序列表的序列1所示的蛋白质；
[0020](a2)序列表的序列3所示的蛋白质。
[0021]重组农杆菌甲是将表达P2
-△
VP8*基因的质粒导入农杆菌得到的；P2
-△
VP8*基因编码P2
-△
VP8*蛋白。
[0022]重组农杆菌乙是将表达P19基因的质粒导入农杆菌得到的；P19基因编码P19蛋白；P19蛋白为序列表的序列7所示的蛋白质。
[0023]P19基因来源于番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)。
[0024]以上任一所述P2
-△
VP8*基因为如下(b1)或(b2)：
[0025](b1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
[0026](b2)编码区如序列表的序列4所示的DNA分子。
[0027]以上任一所述P19基因为编码区如序列表的序列6所示的DNA分子。
[0028]以上任一所述农杆菌为农杆菌EHA105。
[0029]以上任一所述培养植株为培养植株4-7天(例如，5天)。
[0030]以上任一所述总蛋白为可溶性总蛋白。
[0031]表达P2
-△
VP8*基因的质粒具体可为实施例1构建的重组质粒pAT-P2
-△
VP8*。
[0032]表达P19基因的质粒具体可为质粒pBin61-P19。
[0033]将重组农杆菌甲和重组农杆菌乙共侵染本生烟植株具体可为：30天苗龄的本生烟植株，在自下至上计的第5个叶片、第6个叶片和第7个叶片的背面注射侵染液。
[0034]植株叶片被注射重组农杆菌甲和重组农杆菌乙具体可为：30天苗龄的本生烟植株，在自下至上计的第5个叶片、第6个叶片和第7个叶片的背面注射侵染液。
[0035]侵染液的制备方法：
①
将重组质粒pAT-P2
-△
VP8*导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌甲；用MMA溶液重悬重组农杆菌甲，使体系OD
600nm
＝1.0，室温静置2-4小时；
②
将质粒pBin61-P19导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌乙；用MMA溶液重悬重组农杆菌乙，使体系OD
600nm
＝1.0，室温静置2-4小时；
③
将4体积份步骤
①
得到的农杆菌菌液和1体积份步骤
②
得到的农杆菌菌液混合，然后用MMA溶液稀释至体系OD
600nm
＝0.1，即为侵染液。
[0036]所述取植株被侵染的组织，具体可为取被注射过的本叶片。
[0037]提取总蛋白的方法包括如下步骤：取被注射过的本叶片，在预冷的研钵中研磨成粉末，然后按照1g叶片(鲜重)配比2ml蛋白提取缓冲液的比例加入蛋白提取缓冲液，4℃振荡30分钟；然后4℃、15000g离心15分钟，收集上清液；取所述上清液，4℃、15000g离心15分钟，收集上清液。
[0038]从总蛋白中纯化得到P2
-△
VP8*蛋白包括如下步骤：取提取总蛋白得到的上清液，采用Ni-NTA Agarose进行纯化，然后采用孔径为3kDa超滤管进行浓缩，收集浓缩液，然后将缓冲体系更换为蛋白缓冲液，得到的溶液即为P2
-△
VP8
*
蛋白溶液。
[0039]采用Ni-NTA Agarose(Qiagen)进行纯化的具体参数可为：每5ml上清液配比1ml Ni-NTA Agarose，4℃结合2小时；然后用3倍柱体积的Wash缓冲液洗涤；然后用3倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，以收集目标蛋白。
[0040]将缓冲体系更换为蛋白缓冲液采用Zeba
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备P2
-△
VP8*蛋白的方法，包括如下步骤：(1)将重组农杆菌甲侵染本生烟植株，培养植株；(2)取植株被侵染的组织，提取总蛋白；(3)从总蛋白中纯化得到P2
-△
VP8*蛋白；重组农杆菌甲是将表达P2
-△
VP8*基因的质粒导入农杆菌得到的；P2
-△
VP8*基因编码P2
-△
VP8*蛋白；P2
-△
VP8*蛋白为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；(a2)序列表的序列3所示的蛋白质。2.一种制备P2
-△
VP8*重组蛋白的方法，包括如下步骤：(1)将重组农杆菌甲和重组农杆菌乙共侵染本生烟植株，培养植株；(2)取植株被侵染的组织，提取总蛋白；(3)从总蛋白中纯化得到P2
-△
VP8*重组蛋白；重组农杆菌甲是将表达P2
-△
VP8*基因的质粒导入农杆菌得到的；P2
-△
VP8*基因编码P2
-△
VP8*蛋白；P2
-△
VP8*蛋白为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；(a2)序列表的序列3所示的蛋白质；重组农杆菌乙是将表达P19基因的质粒导入农杆菌得到的；P19基因编码P19蛋白；P19蛋白如序列表的序列7所示。3.一种制备P2
-△
VP8*蛋白的方法，包括如下步骤：采用本生烟植株作为生物反应器，植株叶片被注射重组农杆菌甲，然后培养4-7天，然后取所述叶片提取总蛋白，然后从总蛋白中纯化得到P2
-△
VP8*蛋白；重组农杆菌甲是将表达P2
-△
VP8*基因的质粒导入农杆菌得到的；P2
-△
VP8*基因编码P2
-△
VP8*蛋白；P2
-△
VP8*蛋白为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；(a2)序列表的序列3所示的蛋白质。4.一种制备P2
-△
VP8*蛋白的方法，包括如下步骤：采用本生烟植株作为生物反应器，植株叶片被注射重组农杆菌甲和重组农杆菌乙，然后培养4-7天，然后取所述叶片提取总蛋白，然后从总蛋白中纯化得到P2
-△
VP8*蛋白；重组农杆菌甲是将表达P2
-△
VP8*基因的质粒导入农杆菌得到的；P2
-△
VP8*基因编码P2
-△
VP8*蛋白；P2
-△
VP8*蛋白为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；(a2)序列表的序列3所示的蛋白质；重组农杆菌乙是将表达P19基因的质粒导入农杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：张莉莉，方荣祥，谢传淼，宋直钰，霍岩，张玉满，瞿维欢，刘超仁，
申请(专利权)人：植链上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：