一种水稻稻瘟病抗性改良的育种方法技术

本申请公开了一种水稻稻瘟病抗性改良的育种方法，该方法包括：选择功能缺失产生抗性的广谱抗性基因Pi21和Pid3；选择基因Pi21和Pid3的基因编辑位点，并扩增抗病基因的U3或U6 RNA启动子，构建CRISPR/Cas9载体；将CRISPR/Cas9载体导入愈伤组织，通过抗性筛选和分化培养得到T0代转基因植株；检测所述T0代转基因植株的检测子代植株是否含有Cas9外源DNA；筛选功能基因敲除的突变株系，并且扩增突变株系的靶位点DNA，TA克隆测序得到DNA突变信息；在后代中筛选不含Cas9外源DNA的，并且抗病基因Pi21或Pid3发生纯合突变的改良株系。通过本申请解决相关技术中通过CRISPR/Cas9基因编辑技术得到的新品种仍然会受到稻瘟病的侵害的问题，提高了水稻对稻瘟病的抗病性。提高了水稻对稻瘟病的抗病性。提高了水稻对稻瘟病的抗病性。

【技术实现步骤摘要】
一种水稻稻瘟病抗性改良的育种方法


[0001]本申请涉及属于结合基因工程技术的水稻品种改良领域，具体而言，涉及一种水稻稻瘟病抗性改良的育种方法。

技术介绍

[0002]近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术发展较为迅速。CRISPR/Cas9系统已经逐渐发展为遗传育种中改良作物的有效手段，可针对某些有优质稻却存在不良性状的材料进行基因位点编辑，从而获得兼并优良品质与性状的新品种。
[0003]水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的粮食作物之一。但其产量每年都会受制于稻瘟病的暴发，被稻瘟病侵染一般会造成10％-20％的减产，发病严重时可达到40％-50％，有的地区甚至绝产。稻瘟病的危害不仅表现在严重的产量损失，也会严重影响稻米品质。常规育种主要是依靠抗性表型来进行选择，但高度依赖水稻品种、致病小种等因素，选育效率不高，且耗时长。因此，提高稻瘟病抗性，对提高水稻产量仍然有着重要意义。
[0004]稻瘟病是由稻瘟病原菌(Magnaporthe oryzae)侵染引起的病害，在水稻整个生育期中都可发生。目前，除了第3号染色体没有发现抗性基因之外，其余染色体上都有抗性基因分布，现已有二十多个稻瘟病抗性基因得到克隆且进行功能验证(易怒安,李魏,戴良英.水稻抗稻瘟病基因的克隆及其分子育种研究进展[J].分子植物育种,2015,13(07):1653-1659)。Pid3基因是Shang等(Shang J J,Tao Y,Chen X,et al.Identification of a new rice blast resistance gene,Pid3,by genomewide comparison of paired nucleotide-binding site
--
leucine-rich repeat genes and their pseudogene alleles between the two sequenced rice genomes.Genetics.2009Aug；182(4):1303-11)通过设计特异于日本晴NBS-LRR假基因等位基因的PCR分子标记，比较籼稻和粳稻假基因化差异，从籼稻品种
‘
地谷
’
中鉴定出来的一个主效稻瘟病抗性基因。
[0005]之后Chen等(Chen J,Shi Y,Liu W,et al.A Pid3 allele from rice cultivar Gumei2 confers resistance to Magnaporthe oryzae.J Genet Genomics.2011May20；38(5):209-16)从籼稻品种
‘
谷梅2号
’
中利用图位克隆方法分离出一个新的稻瘟病抗性等位基因Pi25，分析表明与Pid3蛋白序列完全一致。Pid3位于第六号染色体上，其cDNA全长为2970bp，包含两个外显子，编码923个氨基酸，含有NBS-LRR结构域和MHD基序的蛋白产物(赵文,王静,李伟滔,等.应用GST pull-down技术筛选水稻抗稻瘟病蛋白PID3互作蛋白的研究[J].植物病理学报,2015,45(05):476-485)。
[0006]但是专利技术人发现，新品种仍然会受到稻瘟病的侵害，从而造成减产等问题。

技术实现思路

[0007]本申请提供一种水稻稻瘟病抗性改良的育种方法，以解决相关技术中新品种仍然会受到稻瘟病的侵害，从而造成减产等问题。
[0008]根据本申请的一个方面，提供了一种水稻稻瘟病抗性改良的育种方法，该方法包
括：根据水稻稻瘟病抗病基因的抗病机理，选择功能缺失产生抗性的广谱抗性基因Pi21和Pid3；选择所述基因Pi21和Pid3的基因编辑位点，并扩增抗病基因的U3或U6 RNA启动子，构建单基因双靶点或双基因四靶点的CRISPR/Cas9载体；以目标水稻品种为遗传受体，将CRISPR/Cas9载体导入愈伤组织，通过抗性筛选和分化培养得到T0代转基因植株；检测所述T0代转基因植株的检测子代植株是否含有Cas9外源DNA；筛选功能基因敲除的突变株系，并且扩增突变株系的靶位点DNA，TA克隆测序得到DNA突变信息；在后代中筛选不含Cas9外源DNA的，并且抗病基因Pi21或Pid3发生纯合突变的改良株系。
[0009]进一步地，选择所述基因Pi21和Pid3的基因编辑位点包括：确定适用于水稻基因突变gRNA序列，利用NCBI对水稻基因组进行BLAST来分析确认靶位点的特异性，排除潜在脱靶序列；其中，靶点接头引物为Pid3-U3-F/R和/或Pid3-U6a-F/R。
[0010]进一步地，扩增抗病基因的U3或U6 RNA启动子，构建单基因双靶点或双基因四靶点的CRISPR/Cas9载体包括：将所连接好的载体通过热激法转入大肠杆菌DH 5α中，挑斑摇菌后抽提质粒，进行PCR扩增，确认载体无误后转入农杆菌EHA 105感受态细胞中。
[0011]进一步地，将CRISPR/Cas9载体导入愈伤组织包括：采用组织培养和农杆菌介导将CRISPR/Cas9载体导入愈伤组织。
[0012]进一步地，采用组织培养和农杆菌介导将CRISPR/Cas9载体导入愈伤组织包括：采用电击法转化农杆菌，将含有基因编辑系统的菌液转化到大粒香愈伤组织中。
[0013]进一步地，通过抗性筛选和分化培养得到T0代转基因植株包括：采用质量浓度50mg/L潮霉素进行筛选，通过共培养、水洗、筛选、预分化、分化、生根获得再生组培苗，之后移栽到土壤中，在温室内进行培养得到所述T0代转基因植株。
[0014]进一步地，筛选功能基因敲除的突变株系，并且扩增突变株系的靶位点DNA包括：取成活再生苗的叶片，抽提叶片组织DNA，设计载体引物SP-ML/R进行阳性鉴定，分别在Pid3靶序列两侧设计扩增引物CRd3-F/R来扩增T0代阳性植株的目的条带。
[0015]进一步地，扩增条件为：95℃变性45秒，57℃退火40秒，72℃延伸70秒，32个循环，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
[0016]进一步地，在后代中筛选不含Cas9外源DNA的，并且抗病基因Pi21或Pid3发生纯合突变的改良株系包括：将T0代突变的crispr-pid3双靶点材料，自交获得T1代种子，提取DNA用载体引物SP-ML/R扩增T1代突变体基因组序列，扩增不出条带的为无转基因成分的突变体植株。
[0017]进一步地，所述方法还包括：田间稻瘟病鉴定和农艺性状拷种鉴定稻瘟病抗性改良株系。
[0018]本申请采用以下步骤：根据水稻稻瘟病抗病基因的抗病机理，选择功能缺失产生抗性的广谱抗性基因Pi21和Pid3；选择所述基因Pi21和Pid3的基因编辑位点，并扩增抗病基因的U3或U6 RNA启动子，构建单基因双靶点或双基因四靶点的CRISPR/Cas9载体；以目标水稻品种为遗传受体，将CRISPR/Cas9载体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
ML/R扩增T1代突变体基因组序列，扩增不出条带的为无转基因成分的突变体植株。10.根据权利要求1至9中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭强，李佳丽，张大双，吴娴，朱速松，
申请(专利权)人：贵州省水稻研究所，
类型：发明
国别省市：