一种基于DNA纳米机器检测谷胱甘肽的生物传感器制造技术

本发明专利技术提供了一种基于DNA纳米机器检测谷胱甘肽的生物传感器，包括银纳米簇、序列如SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
min。
[0013]步骤（3）中，AgNO3和NaHBO4的摩尔比为1:1。
[0014]步骤（4）中，荧光检测的激发波长为574 nm，发射波长为644 nm。
[0015]本专利技术的检测原理如下：传感器中使用的DNA 1、DNA 2、DNA 3序列如下所示：DNA 1（SEQ ID No: 1）：GAATGCTGCGTGTAATCCGTCTGTCCTTTTTTTTTTGGTGTCTAAGTCCCAGAATTCACTTAGACACCCTTCT；DNA 2（SEQ ID No: 2）：GAGTACTAGAGGAACACGCAGCATTCACTTs-sAGAAGGGTGTCTAAGT；DNA 3（SEQ ID No: 3）：GGACAGACGGATTTCCTCTAGTACTCTTTTTTTTTTTGAATTCTGGGACTTAGACACCAGAAGGGTGTCTAAGTCCCACCCACCCGCCCAA。
[0016]传感器中的DNA1单下划线部分与DNA2单下划线部分互补配对，DNA1双下划线部分与DNA3双下划线部分互补配对，DNA2曲线部分与DNA3曲线部分互补配对，从而形成三环模板。其中DNA1和DNA3斜体部分，是spacer。当有目标物的时候，二硫键断裂，加粗部分会从DNA2上释放下来，形成trigger链，并与DNA1的曲线部分互补配对，从而打开DNA1的发夹部分。DNA1的虚线部分与DNA3的曲线部分互补配对，打开DNA3中的发夹部分；DNA3的加粗部分又与DNA1曲线部分杂交，进而进行HCR反应，HCR产物含DNA3的虚线部分，从而引发银簇的合成，通过检测荧光的强度检测谷胱甘肽的浓度。
[0017]本专利技术具有以下优点：本专利技术的传感器利用目标物的特异性识别，实现trigger链的释放，引发HCR。HCR产物暴露出银簇的序列，合成银簇。放大检测信号，提高了检测的灵敏度，实现对目标物谷胱甘肽的超灵敏检测；检测限可达到2
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10-8 M，检测限低。该传感器的构建简单，性能稳定，有效避免了多步加入样品可能带来的污染、繁琐的样品前处理过程，具有灵敏度高、响应快等优势；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测。制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中低廉的要求。适用于谷胱甘肽检测和生物传感器产业化的实际应用。
[0018]本专利技术基于目标物的特异性识别，实现trigger的释放，引发HCR。实现荧光强度的放大，从而构建了荧光生物传感器。该传感器具有检测速度快、操作简单、价格低廉、检测限低、特异性高等优点，可以弥补谷胱甘肽现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速、准确的定量检测。
附图说明
[0019]图1为本专利技术生物传感器的原理图；图2为反应时间优化检测结果图；图3为DNA1浓度优化检测结果图；图4为DNA3浓度优化检测结果图；图5为生物传感器对不同浓度谷胱甘肽荧光扫描；
图6为不同浓度谷胱甘肽的标准曲线。
具体实施方式
[0020]下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。
[0021]实施例1 反应时间的筛选（1）在2 μL 无菌水中加入DNA1（2 μL，100 μM）、DNA2（2 μL，100 μM）、DNA3（2 μL，100 μM）与5
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PBS buffer（2 μL）混合，37 ℃，反应90 min，获得浓度为20 μM的三环模板；（2）取6支1mL的EP管，分别依次加入5
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PBS buffer（pH 7.4，2 μL），三环模板（5 μL，20 μM），谷胱甘肽（1μL，1 mM），混合并在37 ℃下分别孵育40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，发生HCR反应，获得产物；（3）取6支1mL的EP管，依次加入PB缓冲液（76μL，pH 6.5，20mM），15μL步骤（2）产物，AgNO3溶液（4.5μL，2mM），震荡1min，于0-4℃下反应30min；然后分别加入4.5μL NaHBO4溶液（2mM），震荡1min，于0-4℃下反应4h，获得DNA-AgCN；（4）设定激发波长为574 nm，发射波长为644 nm进行荧光检测。
[0022]结果如图2所示，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着反应时间的延长而增大，当反应时间超过90 min后，荧光强度趋于稳定，因此选择反应时间为90 min。
[0023]实施例2 DNA浓度变化的筛选（1）在2 μL 无菌水中加入浓度为50 μM、60 μM、70 μM、80 μM、90 μM、100 μM的DNA1（2 μL）分别与DNA2（2 μL，100 μM）、DNA3（2 μL，100 μM）、5
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PBS buffer（2 μL）混合，37 ℃，反应90 min，获得不同浓度的三环模板；（2）取6支1mL的EP管，分别依次加入5
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PBS buffer（pH 7.4，2 μL），步骤（1）获得的三环模板（5 μL），谷胱甘肽（1μL，1 mM），混合并在37 ℃下分别孵育90 min，发生HCR反应，获得产物；（3）取6支1mL的EP管，依次加入PB缓冲液（76μL，pH 6.5，20mM），15μL步骤（2）产物，AgNO3溶液（4.5μL，2mM），震荡1min，于0-4℃下反应30min；然后各管中分别加入4.5μL NaHBO4溶液（2mM），震荡1min，于0-4℃下反应4h，获得DNA-AgCN；（4）设定激发波长为574 nm，发射波长为644 nm进行荧光检测。
[0024]结果如图3所示，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着DNA1浓度的增大而增大，当DNA1浓度100 μM时，荧光强度趋于稳定。所以最佳的DNA 1浓度为100 μM。
[0025]同样的方法，筛选DNA3的最佳浓度，固定步骤（1）中DNA1的浓度为100 μM，结果如如图4所示，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着DNA 3浓度的增大而增大，当DNA 3浓度100 μM时，荧光强度趋于稳定。所以最佳的DNA 3浓度为100 μM。
[0026]实施例3 生物传感器对谷胱甘肽的检测（1）在2 μL 无菌水中加入DNA1（2 μL，100 μM）、DNA2（2 μL，100 μM）、DNA3（2 μL，100 μM）与5
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PBS buffer（2 μL）混合，37 ℃，反应90 min，获得浓度为20 μM的三环模板；（2）取7支1mL的EP管，分别依次加入5
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PBS buffer（pH 7.4，2 μL），三环模板（5 μL，20 μM），系列浓度谷胱甘肽溶液（1μL，使得在荧光检测体系中的终浓度分别为0 M，1
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10-8 M、1
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10-7 M、1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA纳米机器检测谷胱甘肽的生物传感器，其特征在于，包括纳米银簇，序列分别如SEQ ID No: 1-3所示的DNA 1、DNA 2、DNA 3，所述DNA 2序列的第30和31位碱基间通过二硫键连接。2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述纳米银簇通过在溶液中硼氢化钠0-4℃下还原硝酸银获得。3.一种权利要求1或2所述的生物传感器在检测谷胱甘肽中的应用。4.一种含有权利要求1或2所述的生物传感器的试剂盒。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括系列浓度谷胱甘肽标准溶液。6.一种利用权利要求1或2所述的生物传感器或权利要求4-5任一所述的试剂盒检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将DNA 1、DNA 2、DNA 3杂交成...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉，孙文玉，刘素，黄加栋，王业茹，江龙，张曼茹，徐婉晴，朱志学，张清心，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：