本发明专利技术提供一种同时检测DNA多种甲基转移酶的生物传感器及其检测方法和应用，属于分子检测技术领域。所述生物传感器至少包括：哑铃式探针、环形模板和信号探针。通过该设计一种具有双信号放大功能的哑铃探针，其具有两种甲基化酶的识别位点，从而基于哑铃探针的双信号放大技术同时配合环形模板和信号探针从而实现对种甲基化酶的超灵敏检测，因此在生物医学研究，疾病诊断和药物发现中具有巨大的潜力，具有良好的实际应用之价值。具有良好的实际应用之价值。具有良好的实际应用之价值。
【技术实现步骤摘要】
一种同时检测DNA多种甲基转移酶的生物传感器及其检测方法和应用
[0001]本专利技术属于分子检测
，具体涉及一种同时检测多种DNA甲基转移酶的生物传感器及其检测方法和应用。
技术介绍
[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]DNA甲基转移酶(MTases)异常表达与多种疾病密切相关，DNA甲基转移酶(MTases)的异常活性可能破坏正常的DNA甲基化模式，诱发多种癌症，包括肺癌，乳腺癌，前列腺癌，结肠癌，肝癌，肾癌，宫颈癌，甲状腺癌，成视网膜细胞瘤，和血液系统癌症等。DNA甲基转移酶(MTases)成为临床疾病诊断的潜在生物标志物。此外，抑制DNA甲基转移酶(MTases)活性可能会阻断DNA甲基化，为抗癌药物的研发提供了新途径。因此，DNA甲基转移酶(MTases)的灵敏检测在生物医学研究和临床诊断中具有重要意义。
[0004]DNA甲基转移酶(MTases)活性传统的检测方法包括放射性标记法，酶联免疫测定法和高效液相色谱法，但是这些方法通常会产生放射性污染，耗时长且灵敏度低。最近，已经开发出了一系列基于DNA探针的新型方法来灵敏地检测DNA甲基转移酶(MTases)的活性，包括比色法，化学发光法，电化学法，表面增强拉曼散射法，和荧光法。双链DNA(dsDNA)，发夹DNA探针和分子信标通常用作DNA甲基转移酶(MTases)的底物。但是，将它们应用于检测多个DNA甲基转移酶(MTases)时存在一些限制。例如，同时检测多种DNA甲基转移酶(MTases)时需要额外的底物探针和不同标记的荧光团，这使实验过程变得复杂并增加了成本。
[0005]专利技术人发现，传统检测方法中，放射性标记法中的放射性元素可能会对人体健康和环境造成危害，酶联免疫测定法步骤繁琐，成本较高。高效液相色谱法耗时较长，且灵敏度不高。新型的检测方法包括比色法，化学发光法，电化学法，表面增强拉曼散射法，和荧光法。但是将它们应用于同时检测多种DNA甲基转移酶(MTases)时存在一些限制，这些方法需要额外的底物探针和不同颜色的荧光团，这使实验过程变得复杂并增加了成本。因此开发一种简单灵敏并且可以同时检测多种DNA甲基转移酶(MTases)的方法是一个巨大的挑战。
技术实现思路
[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种同时检测多种DNA甲基转移酶的生物传感器及其检测方法和应用。在生物传感器中通过该设计一种具有双信号放大功能的哑铃探针，其具有两种甲基化酶的识别位点，从而基于哑铃探针的双信号放大技术同时配合环形模板和信号探针从而实现对种甲基化酶的超灵敏检测，因此具有良好的实际应用之价值。
[0007]为实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]本专利技术的第一个方面，提供一种同时检测多种DNA甲基转移酶的生物传感器，所述生物传感器至少包括：哑铃式探针、环形模板和信号探针。
[0009]其中，所述哑铃式探针包括茎区域和位于茎区域两端的两个环区域；其中茎区域包含待测甲基转移酶的识别序列；
[0010]所述环形模板用于滚环扩增(RCA)，其至少包括引物结合位点、Nb.BtsI的切口位点和与信号探针互补的片段；
[0011]所述信号探针用于触发Endo IV辅助信号放大反应，其至少含有一个脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点，所述AP位点两侧分别被荧光基团和猝灭基团修饰。
[0012]本专利技术的第二个方面，提供上述生物传感器在DNA甲基转移酶中的应用；
[0013]更具体的，所述DNA甲基转移酶至少为两个；
[0014]所述DNA甲基转移酶包括但不限于DNA腺嘌呤甲基转移酶(Dam)、胞嘧啶甲基转移酶(M.SssI)。
[0015]本专利技术的第三个方面，提供一种同时检测多种DNA甲基转移酶的方法，所述方法包括：
[0016]1)将待测样品和哑铃式探针混合反应后高温终止反应；
[0017]2)将步骤1)产物加入环形模板进行滚环扩增反应后高温终止反应；
[0018]3)将步骤2)所得RCA产物与信号探针混合进行核酸内切酶IV辅助的信号放大反应并高温终止反应。
[0019]所述检测方法还包括采用荧光检测系统测定荧光信号，从而实现对DNA甲基转移酶的定量检测。
[0020]本专利技术的第四个方面，提供上述生物传感器和/或检测方法在DNA甲基转移酶活性检测和/或筛选DNA甲基转移酶药物中的应用。
[0021]与现有技术相比，上述一个或多个技术方案存在如下有益技术效果：
[0022]1)上述技术方案设计的哑铃探针将目标识别和信号放大功能集成到一个多功能探针中，简化了探针设计，降低了实验成本。
[0023]2)RCA在实际应用中的一大挑战是由非特异性分子间和分子内交联引起的非特异性扩增，上述技术方案中将哑铃探针与RCA整合在一起，来有效消除非特异性扩增引起的高背景信号。
[0024]3)上述技术方案高效率的双信号放大技术导致荧光信号的增强。
[0025]4)上述技术方案以均相形式进行，而无需任何洗涤和分离步骤。
[0026]5)上述技术方案极其灵敏，经试验验证，其对Dam的检出限为2.15
×
10-5
单位每毫升，对M.SssI的检出限为3.23
×
10-6
单位每毫升，优于已报道的方法。
[0027]综上，上述技术方案可用于筛选酶抑制剂，同时测量复杂生物样品中的Dam和M.SssI。重要的是，上述技术方案可以通过简单地改变两个识别序列扩展到同时检测多种核酸内切酶，并来筛选相应的抑制剂。因此在生物医学研究，疾病诊断和药物发现中具有巨大的潜力，具有良好的实际应用之价值。
附图说明
[0028]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示
意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0029]图1为本专利技术基于哑铃式探针介导的双重信号放大技术的荧光方法用于同时检测Dam和M.SssI的示意图；其中，A为哑铃式探针结构示意图；B为检测示意图。
[0030]图2为采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，以SYBR Gold作为指示剂验证本专利技术实施例可行性结果图。其中，(A)以SYBR Gold为指示剂对甲基化和裂解反应的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析。M道，DNA Maker；通道1，哑铃探针；通道2，Dam+哑铃探针；通道3，M.SssI+哑铃探针；通道四，Dam+M.SssI+哑铃形探针。(B)以Cy3和Cy5为指示信号的Dam和M.SssI诱导的Endo IV辅助信号放大反应的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析。通道1，Dam+Cy3标记的信号探针1；通道2，M.SssI+Cy5标记的信号探针2；通道3，Dam+M.SssI+Cy3标记的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种同时检测多种DNA甲基转移酶的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器至少包括：哑铃式探针、环形模板和信号探针；其中，所述哑铃式探针包括茎区域和位于茎区域两端的两个环区域；其中茎区域包含待测甲基转移酶的识别序列；所述环形模板用于滚环扩增，其至少包括引物结合位点、Nb.BtsI的切口位点和与信号探针互补的片段；所述信号探针用于触发Endo IV辅助信号放大反应，其至少含有一个脱嘌呤/脱嘧啶位点，所述AP位点两侧分别被荧光基团和猝灭基团修饰。2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，当待测甲基转移酶为两个时，在靠近第一环区域的位置设计第一待测甲基转移酶识别序列；在靠近第二环区域的位置设计第二待测甲基转移酶的识别序列；所述环形模板和信号探针均为两个；其中，第一环形模板的引物结合位点与哑铃式探针在第一待测甲基转移酶识别序列处裂解释放裂解产物结合并引发RCA反应得第一DNA产物；第二环形模板的引物结合位点与哑铃式探针在第二待测甲基转移酶识别序列处裂解释放裂解产物结合并引发RCA反应得第二DNA产物；第一信号探针与上述第一DNA产物杂交结合形成带有AP位点的第一双链DNA，所述第一双链DNA被Endo IV裂解从而释放第一产物和第一荧光基团；所述第一产物继续结合第一信号探针杂交形成具有AP位点的DNA双链体，从而引发Endo IV诱导的第一信号探针的循环裂解反应，释放出大量第一荧光基团；第二信号探针与上述第二DNA产物杂交结合形成带有AP位点的第二双链DNA，所述第二双链DNA被Endo IV裂解从而释放第二产物和第二荧光基团；所述第二产物继续结合第二信号探针杂交形成具有AP位点的DNA双链体，从而引发Endo IV诱导的第二信号探针的循环裂解反应，释放出大量第二荧光基团。3.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器还包括酶和缓冲液。4.如权利要求3所述的生物传感器，其特征在于，所述酶包括DpnI、GlaI、Vent(exo-)DNA聚合酶、Nb.BbtsI和核酸内切酶IV...
【专利技术属性】
技术研发人员：张春阳，李玥颖，孙淑丽，田小锐，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：
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