一种高效表达新型冠状病毒N蛋白的方法技术

本发明专利技术属于免疫技术领域，具体涉及一种高效表达新型冠状病毒N蛋白的方法。本发明专利技术按照2.0％‑3.0％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，培养温度为35‑37℃，pH值维持在7.3‑7.5，维持溶氧水平在30％左右；当初始碳源耗尽后，根据溶氧反馈补料策略，溶氧水平升至50％‑60％时补加50％‑80％甘油溶液；溶氧水平降至20％‑30％时停止补加，如此反复；当细菌浓度达到1.0‑3.0时，加入0.3‑1mM IPTG进行诱导，且继续培养2h后，再次加入0.3mM IPTG进行二次诱导，总诱导为6‑8h。可以实现新冠病毒截短N蛋白的可溶性高效表达，能满足大规模生产可溶性新冠病毒N蛋白的需求。

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达新型冠状病毒N蛋白的方法
：本专利技术属于免疫
，具体涉及一种高效表达新型冠状病毒N蛋白的方法。
技术介绍
：目前，“早发现早隔离”仍是应对新型冠状病毒感染的最有效措施，则这对检测技术提出了较高要求。目前临床主要通过肺部CT、样本核酸进行检测。肺部CT只能确定病人疑似感染和病人肺部感染进程，核酸检测耗时较长，且易出现假阴性；同时，这些方法对检测人员和仪器要求高，不适宜早期诊断和大面积筛查。基于新型冠状病毒特异蛋白建立的血清学检测方法和抗原抗体检测方法，不仅具有成本低、速度快、灵敏度高等特点，而且可大幅降低漏诊率，也不需要昂贵的仪器和专业技术人员，适合早期大规模筛查。N蛋白(NucleocapsidProtein)是病毒的核衣壳蛋白，它具有两个RNA结合结构域起到保护基因组的作用。同时，N蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中所占比例最大，感染早期机体就能产生抗N蛋白的高水平抗体，可以利用N蛋白建立快速检测COVID-19血清抗体的方法。在我们前期研究中，通过新型冠状病毒N蛋白与SARS、MERS在内的另外6个感染人的冠状病毒及流感病毒等呼吸道感染病毒的基因序列分析及蛋白质同源性分析，得到新型冠状病毒截短的N蛋白；该蛋白检测COVID-19具有敏感性高、特异性好，假阳性率明显降低等优点，其中，敏感性较全长N蛋白高出约60～100％，特异性达到98.57％。因此，提高该蛋白的表达水平对COVID-19检测试剂盒制备和COVID-19的大范围检测具有重要意义。
技术实现思路
：为了解决上述技术问题，本专利技术将提供一种高效表达截短N蛋白的发酵培养基及诱导表达方法，可以实现新冠病毒截短N蛋白的可溶性高效表达，能满足大规模生产可溶性新冠病毒N蛋白的需求。所述截短的N蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO.1所示；编码所述截短的N蛋白的核酸分子如序列表SEQIDNO.2所示；所述的发酵培养基组成如下：葡萄糖3.0-7.0g/L、甘油5.0-15.0g/L、酵母粉7.5-12.5g/L、蛋白胨4.0-6.0g/L、KH2PO42.0-4.9g/L、(NH4)2SO43.0-5.0g/L、MgSO41.0-2.0g/L、FeSO40.1-0.2g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L、VB110.0-15.0mg/L、VH3.0-5.0mg/L、三甲基甘氨酸2.0-5.0g/L；pH7.3-7.5。优选地，发酵培养基组成如下：葡萄糖5.0g/L、甘油10.0g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨5g/L、KH2PO43.0g/L、(NH4)2SO44.0g/L、MgSO41.5g/L、FeSO40.15g/L、柠檬酸钠2.0g/L、VB112.0mg/L、VH5.0mg/L、三甲基甘氨酸3.0g/L；pH7.5。所述诱导表达方法具体为：按照2.0％-3.0％的接种量将表达上述截短N蛋白菌种的种子液接种至发酵培养基中，培养温度为35-37℃，pH值维持在7.3-7.5，维持溶氧水平在30％左右；当初始碳源耗尽后，根据溶氧反馈补料策略，溶氧水平升至50％-60％时补加50％-80％(w/v)甘油溶液；溶氧水平降至20％-30％时停止补加，如此反复；当细菌浓度达到1.0-3.0(OD600)时，加入0.3-1mmol/LIPTG进行诱导，且继续培养2h后，再次加入0.3mmol/LIPTG进行二次诱导，总诱导为6-8h。优选地，按照2.0％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，培养温度为37℃，利用25％氨水将pH值维持在7.5，调节搅拌转速和通气量维持溶氧水平在30％左右；当初始碳源耗尽后，根据溶氧反馈补料策略，溶氧水平升至50％时补加50％(w/v)甘油溶液；溶氧水平降至20％时停止补加，如此反复；当细菌浓度达到2.0(OD600)时，加入0.3mmol/LIPTG进行诱导，且继续培养2h后，再次加入0.3mmol/LIPTG进行二次诱导，总诱导为6h。有益效果：本专利技术提供的用于检测COVID-19的重组N蛋白为血清学检测COVID-19提供了一种新的选择，采用SEQIDNO.1所示的截短N蛋白检测COVID-19具有敏感性高、特异性好，假阳性率明显降低等优点，其中，敏感性较全长N蛋白高出约60～100％，特异性达到98.57％，应用前景广泛。采用本专利技术提供的诱导和表达方法，可溶性N蛋白表达水平较初始表达工艺提高了10倍以上。本专利技术可以实现新冠病毒N蛋白的可溶性高效表达，在50L发酵罐中大规模培养后，细菌浓度、单位菌体N蛋白浓度以及N蛋白表达水平分别为14.32g/L、18.12mg/g、259.48mg/L，能满足大规模生产可溶性新冠病毒N蛋白的需求。附图说明：图1E.coliBL21-N菌株的双酶切鉴定其中，M：DNAMarker，1：质粒，2：双酶切产物；图2不同培养基种类对细菌浓度及N蛋白表达水平的影响；图3补加碳源种类对细菌浓度及N蛋白表达水平的影响；图4三甲基甘氨酸添加浓度对细菌浓度及N蛋白表达水平的影响；图5诱导剂种类对细菌浓度及N蛋白表达水平的影响；图6IPTG浓度对细菌浓度及N蛋白表达水平的影响；图7诱导时间对细菌浓度及N蛋白表达水平的影响；图8二次诱导时间对细菌浓度及N蛋白表达水平的影响；图9应用本专利技术工艺与初始工艺进行N蛋白表达；其中，图2-9中，(a)细菌湿重，(b)单位菌体可溶性N蛋白浓度，(c)单位体积可溶性N蛋白浓度。图10不同浓度洗脱液洗脱N蛋白效果及浓缩后N蛋白鉴定其中，(a)M：蛋白Marker，1：纯化前，2：穿透液，3：50mM咪唑洗杂，4：80mM咪唑洗杂，5：100mM咪唑洗脱(第一次)，6：100mM咪唑洗脱(第二次)，7：100mM咪唑洗脱(第三次)，8：150mM咪唑洗脱(第一次)，9：150mM咪唑洗脱(第二次)，10：150mM咪唑洗脱(第三次)，11：200mM咪唑洗脱(第一次)，12：200mM咪唑洗脱(第二次)；(b)：M：蛋白Marker，1：浓缩后N蛋白。具体实施方式：为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本专利技术。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本专利技术中。本专利技术所涉及的截短N蛋白，可根据氨基酸序列人工合成获得，也可通过基因工程的手段构建重组菌进行表达、分离和纯化获得。SEQIDNO.1所示的截短N蛋白，全长241个氨基酸，序列如下：MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRGGGGSGGGGSGGGGSMAGNGGD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效表达截短N蛋白的方法，其特征在于，所述截短的N蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效表达截短N蛋白的方法，其特征在于，所述截短的N蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。


2.如权利要求1所述的一种高效表达截短N蛋白的方法，其特征在于，采用的发酵培养基组成如下：葡萄糖3.0-7.0g/L、甘油5.0-15.0g/L、酵母粉7.5-12.5g/L、蛋白胨4.0-6.0g/L、KH2PO42.0-4.9g/L、(NH4)2SO43.0-5.0g/L、MgSO41.0-2.0g/L、FeSO40.1-0.2g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L、VB110.0-15.0mg/L、VH3.0-5.0mg/L、三甲基甘氨酸2.0-5.0g/L；pH7.3-7.5。


3.如权利要求2所述的一种高效表达截短N蛋白的方法，其特征在于，采用的发酵培养基组成如下：葡萄糖5.0g/L、甘油10.0g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨5g/L、KH2PO43.0g/L、(NH4)2SO44.0g/L、MgSO41.5g/L、FeSO40.15g/L、柠檬酸钠2.0g/L、VB112.0mg/L、VH5.0mg/L、三甲基甘氨酸3.0g/L；pH7.5。


4.如权利要求2所述的一种高效表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：程立坤，王静，杨秀艳，赵修报，杨光，林初文，王景超，董艳凯，沈志强，
申请(专利权)人：清源生物深圳有限公司，山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州医学院附属医院，清源之光武汉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44