一种替代中和效力测定的ELISA方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种IBV特异性中和表位抗原多肽，所述多肽为环状多肽，所述多肽的氨基酸序列为CSCPYVSYGRFCIQPDGSIKQC。本发明专利技术还公开了一种IBV特异性抗体及其制备方法。本发明专利技术还公开了一种替代中和效力测定的ELISA方法。本发明专利技术还公开了一种ELISA检测试剂盒，本发明专利技术应用建立的pELISA方法检测IBV抗体，并发现其与抗IBV中和抗体呈正相关，本发明专利技术可以用于IBV疫苗免疫效果的评价，IBV感染鸡的抗体水平测定，从而有益于鸡群健康管理等。

【技术实现步骤摘要】
一种替代中和效力测定的ELISA方法及其应用技术方案本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种替代中和效力测定的ELISA方法及其应用。
技术介绍
传染性支气管炎(IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的传染病。IBV感染鸡引起严重的呼吸道和肾脏疾病，导致重大的经济损失。虽然疫苗现在被广泛使用，但是在鸡群中仍然可以观察到IB的流行。中和抗体是当病原微生物侵入机体时会产生相应的抗体。病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，防止侵入细胞。中和抗体是由适应性免疫应答细胞分泌的一种可溶性蛋白。病毒侵入机体之后，免疫细胞将中和抗体分泌到血液里，后者与血液里的病毒颗粒结合，阻止病毒感染细胞，破坏病毒颗粒，这样就把病毒“中和”掉了。目前一般采用细胞培养方法检测血清中的中和抗体滴度，从而评估疫苗在免疫鸡群中的效用，然而，这个过程耗时费力，难以在基层实现。有报道称免疫荧光和酶联免疫吸附试验可以替代病毒的中和试验，可以更快更简单的方法来测定血清中和抗体的滴度，最近的研究表明，狂犬病毒和牛病毒性腹泻病毒糖蛋白ELISA可以分别测定人和牛接种疫苗后血清中的中和抗体效价。间接ELISA和中和试验之间抗体滴度的相关性也在寨卡病毒和人类乳突病毒中进行了研究。虽然已经开发了用全病毒粒子或重组S1蛋白、N蛋白和非结构蛋白检测抗体的ELISA方法，迄今为止，还没有血清学方法替代传染性支气管炎病毒的中和试验。
技术实现思路
专利技术目的：IBV基因组编码4种主要结构蛋白：S、E、M和N，另外还有十五种非结构蛋白和一些附属蛋白。在这些蛋白中，S糖蛋白被认为是携带中和性表位主要的保护性抗原，可以诱导中和抗体的产生，然而，S1在不同毒株的IBV中差异很大。S2是一个高度保守的蛋白，携带广泛的抗原表位，S2蛋白也存在相关中和性抗原表位。我们的研究也表明S2存在一个广谱的中和表位。本专利技术中，我们合成了该中和表位的多肽，在建立检测IBV抗体ELISA方法的基础上，发现其与中和抗体滴度具有相关性，可以用于中和抗体的评价测定。本专利技术的所述多肽ELISA检测的血清抗体水平与中和抗体水平呈正相关性。本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种替代中和效力测定的ELISA方法，所述该技术可以应用于疫苗免疫后的中和抗体水平评估。本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种IBV特异性抗体及其制备方法。本专利技术还要要解决的技术问题是提供了IBV特异性中和表位抗原多肽在制备IBV检测试剂盒方面的应用。本专利技术最后要解决的技术问题是提供了一种ELISA检测试剂盒。技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种IBV特异性中和表位抗原多肽，所述多肽为环状多肽，所述环状多肽的氨基酸序列为CSCPYVSYGRFCIQPDGSIKQC。本
技术实现思路
还包括一种IBV特异性抗体，所述IBV特异性抗体特异性的与所述的IBV特异性中和表位抗原多肽结合。本
技术实现思路
还包括一种IBV特异性抗体的制备方法，将所述的IBV特异性中和表位抗原多肽与佐剂混合，免疫小鼠、鸡或其他实验动物，经2-3次免疫后即可产生抗IBV特异性抗体。本
技术实现思路
还包括一种替代中和效力测定的ELISA方法，包括以下步骤：1)将所述的IBV特异性中和表位抗原多肽包被酶标板，包被后用兔血清封闭；2)洗涤多次后，加入鸡血清共同孵育；3)再次洗涤多次，再与山羊抗鸡IgG酶标抗体共同孵育，经多次洗涤后，用TMB底物显色；4)最后用0.1％SDS终止反应，用酶联免疫吸附分析仪检测650nm的吸光度，从而检测出个体中IBV的中和抗体水平。本
技术实现思路
还包括所述的IBV特异性中和表位抗原多肽在制备IBV检测试剂盒方面的应用。本
技术实现思路
还包括一种ELISA检测试剂盒，所述ELISA试剂盒包括权利要求1所述的IBV特异性中和表位抗原多肽。其中，所述ELISA试剂盒包括以下组分：包被所述的IBV特异性中和表位抗原多肽的酶标板、酶标抗体、底物溶液、终止液、洗涤液、阴性对照和阳性对照。其中，所述酶标抗体为山羊抗鸡IgG酶标抗体G。其中，所述底物溶液为TMB底物显色溶液。其中，所述阴性对照为SPF鸡血清。其中，所述阳性对照为SPF鸡免疫IBV后的血清。有益效果：本专利技术应用建立的pELISA方法可以检测出目前已知所有类型IBV的抗体，而常规ELISA仅能检测出经典IBV毒株诱导产生的抗体，并发现本方法与抗IBV中和抗体呈正相关，本专利技术可以用于IBV疫苗免疫效果的评价，IBV感染鸡的抗体水平测定，从而有益于鸡群健康管理等。附图说明图1环状多肽与不同病毒血清样本反应后用酶联免疫吸附分析仪检测650nm的吸光度；图2不同病毒株免疫血清样品的中和抗体与ELISA抗体的相关性比较；图3M41和CK/CH/2010/JT1感染鸡后中和抗体和ELISA抗体具有很好的相关性比较。具体实施方式下面结合具体的实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于申请所附权利要求书所限定的范围。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。实施例1肽的合成：按常规方法合成环状多肽CSCPYVSYGRFCIQPDGSIKQC，色谱鉴定纯度大于95％。按常规方法合成多肽SCPYVSYGRFCIQPDGSIKQ，色谱鉴定纯度大于95％。pELISA方法：将合成的环状多肽CSCPYVSYGRFCIQPDGSIKQC和多肽SCPYVSYGRFCIQPDGSIKQ在0.1μg/mL用pH9.60.05M的碳酸盐缓冲液中分别包被ELISA板，在4℃条件下过夜包被。用8％兔血清在37℃下封闭3小时。PBST清洗3次后，将100μL抗IBV鸡血清(PBST进行1∶200稀释)加入，在37℃下孵育1小时，然后清洗5次，再与100μL山羊抗鸡IgG酶标抗体(Jackson公司产品)在37℃下孵育1小时。经5次洗涤后，用100μLTMB底物在37℃显色15min。100μL1％的SDS终止反应。用酶联免疫吸附分析仪检测650nm的吸光度。该方法与抗禽流感病毒(AIV)、禽白血病病毒(ALV)、禽网状内皮增生病毒(REV)、鹅瘟病毒(GPV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、马立克氏病病毒(MDV)、鸡产蛋下降综合症病毒(EDV)等病毒的阳性血清样本没有反应性。如图1，是环状多肽CSCPYVSYGRFCIQPDGSIKQC与不同病毒血清终止反应后用酶联免疫吸附分析仪检测650nm的吸光度，0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种IBV特异性中和表位抗原多肽，其特征在于，所述多肽为环状多肽，所述多肽的氨基酸序列为CSCPYVSYGRFCIQPDGSIKQC。/n

【技术特征摘要】
1.一种IBV特异性中和表位抗原多肽，其特征在于，所述多肽为环状多肽，所述多肽的氨基酸序列为CSCPYVSYGRFCIQPDGSIKQC。


2.一种IBV特异性抗体，其特征在于，所述IBV特异性抗体特异性的与权利要求1所述的IBV特异性中和表位抗原多肽结合。


3.一种IBV特异性抗体的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的IBV特异性中和表位抗原多肽与佐剂混合，免疫小鼠、鸡或其他实验动物，经2-3次免疫后即可产生抗IBV特异性抗体。


4.一种替代中和效力测定的ELISA方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将权利要求1所述的IBV特异性中和表位抗原多肽包被酶标板，包被后用兔血清封闭；
2）洗涤多次后，加入鸡血清共同孵育；
3）再次洗涤多次，再与山羊抗鸡IgG酶标抗体共同孵育，经多次洗涤后，用TMB底物显色；
4）最...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦爱建，张昱晗，武奇，钱琨，邵红霞，叶建强，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32