一种新型冠状病毒N蛋白抗原变体及其在新型冠状病毒抗体检测中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种新型冠状病毒N抗原变体及其在新冠抗体检测中的应用，涉及N蛋白重要抗原表位多肽的变体，这些变体降低了新型冠状病毒N蛋白作为捕获抗原与其它冠状病毒抗体如SARS、人流感冠状病毒抗体的非特异性反应。所述的多肽具有冠状病毒N蛋白表位肽活性并且在C端添加半胱氨酸残基；所述的突变发生的氨基酸残基位点选自：第342的赖氨酸、第347的赖氨酸、第387的赖氨酸、第388的赖氨酸突变为同源性较低的氨基酸；所述的N蛋白340‑419多肽序列如SEQ ID NO 7所示。本发明专利技术还披露了所述变体的抗原组合物、用途和方法。

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒N蛋白抗原变体及其在新型冠状病毒抗体检测中的应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种新型冠状病毒N蛋白抗原变体及其在新型冠状病毒抗体检测中的应用，该抗原变体在有效捕获病毒抗体同时，大幅降低了因全长N蛋白的非特异性反应所造成的病毒抗体检测的假阳性问题，有效提高了新型冠状病毒抗体检测的专属性。
技术介绍
新型冠状病毒（novelSevereAcuteRespiratorySyndromeCoronavirus2,SARS-CoV-2）是一种具有急性呼吸道传染性的RNA病毒。截至2020年7月底，新型冠状病毒已引起全球约1800万人感染，69万人死亡。表面有冠状刺突的球状新型冠状病毒外部是由多种蛋白组成的壳，分别是刺突糖蛋白（S，Spikeprotein）、小包膜糖蛋白（E，EnvelopProtein）、膜糖蛋白（M,MembraneProtein）。病毒内部是由N蛋白与病毒RNA形成核糖核蛋白复合物，N蛋白是一种多功能结构蛋白，具有增强病毒基因组转录、破坏各种宿主细胞活动而对宿主细胞产生毒性等不同特征。新型冠状病毒的N蛋白、E蛋白和S蛋白在病毒感染人体后，刺激浆细胞产生特异性抗体，具有较强的抗原性，被广泛应用于新冠抗体血清学检测产品中。截至2020年5月底，国家药品监督管理局一共应急审批通过了44个新冠检测试剂及设备，其中有18个新冠抗体血清学检测产品。获批的新冠病毒抗体检测试剂盒都以常规冠状病毒抗原S和N蛋白，尤其是以N蛋白作为抗体捕获抗原。N蛋白作为抗体捕获蛋白有诸多优点，分子量相对较小，没有糖基化，使其容易在成本较低的原核或低等真核表达系统中得到高效表达。更重要的是N蛋白抗原性强，根据SARS的血清学研究，利用SARS病毒N蛋白的抗体检测试剂具有很高的灵敏度，90-100%的SARS病人血清能与N蛋白产生抗原抗体反应，而仅有78%的SARS阳性病人血清与S蛋白反应。N蛋白是最保守和最稳定的蛋白。SARS-CoV-2的N蛋白与SARS-CoVN蛋白具有90％的氨基酸序列同一性，与造成季节性流感的人类冠状病毒HCoVs，如HCoV-OC43和HCoV-229E等也有极高同源性。Gorse等人在2010年发表文章揭示全球有90%的人群具有针对流感人类冠状病毒的抗体。Woo等研究者在2004年的一项研究发现使用全长N蛋白检测SARS病毒抗体时，假阳性率高达87%（在检测阳性的33个样本中有29个为假阳性）。而2006年Maache等学者的一项研究也指出N蛋白用于测SARS抗体完全无法区分阳性血清和健康人血清。而基于S蛋白的抗体检测则具有较低的假阳性率。
技术实现思路
本专利技术目的是：提供一种新型冠状病毒N蛋白抗原变体，在有效捕获病毒抗体同时，大幅降低了因全长N蛋白的非特异性反应所造成的病毒抗体检测的假阳性问题。本专利技术的再一目的在于：提供上述变体在新型冠状病毒抗体检测中的应用。本专利技术提供了一种冠状病毒N蛋白的抗原肽，在有效捕获病毒抗体同时，大幅降低了因全长N蛋白的非特异性反应所造成的病毒抗体检测的假阳性问题，有效提高了新型冠状病毒抗体检测的专属性。本专利技术提供了一种多肽，所述的多肽是冠状病毒N蛋白表位肽的突变体，具有冠状病毒N蛋白表位肽活性并且在C端添加半胱氨酸残基，在本专利技术中称为冠状病毒N蛋白表位肽变体；突变发生的氨基酸残基位点选自：第342的赖氨酸、第347的赖氨酸、第387的赖氨酸、第388的赖氨酸突变为同源性较低的氨基酸；所述的冠状病毒N蛋白编码第340-419的多肽序列如SEQIDNO7所示。所述的N蛋白可以是冠状病毒的N蛋白，例如SEQIDNO1显示了新冠病毒N蛋白的序列。较好的，所述的突变发生的氨基酸残基突变为丙氨酸。即在新型冠状病毒N蛋白340-419间80个氨基酸残基的多肽的基础上，在N蛋白的第342的赖氨酸（K）或/和第347的赖氨酸（K）或/和第387的赖氨酸（K）或/和第388的赖氨酸（K）突变为同源性较低的氨基酸，并且C端添加半胱氨酸（C）残基。较好的，所述的多肽的序列如SEQIDNO2-SEQIDNO6中任意一条所示。N蛋白表位肽活性是指，该多肽能够被N蛋白的抗体识别或者与N蛋白的抗体识别，相应的多肽能够指示N蛋白的存在。另外，本专利技术还提供了所述的多肽在制备检测冠状病毒N蛋白的试剂中的应用。例如，所述的多肽可以作为检测冠状病毒N蛋白的检测标志物，用于捕获或者筛选识别冠状病毒N蛋白的抗体。较好的，所述的应用包括以下步骤：制备冠状病毒N蛋白表位肽变体；和/或将冠状病毒N蛋白表位肽变体与载体蛋白或者大分子聚合物偶联；检测识别冠状病毒N蛋白的抗体的存在。制备冠状病毒N蛋白表位肽变体包括人工合成或者使用生物体表达产生所述的多肽或者其衍生物。人工合成包括化学合成冠状病毒N蛋白表位肽变体或者其衍生物。本专利技术中，也可以将编码冠状病毒N蛋白表位肽变体的核酸连接到表达载体，导入宿主细胞内如酵母菌、大肠杆菌，在适合条件下表达所述多肽。较好的，所述的载体蛋白选自BSA、HSA、KLH、OVA，或者是检测上可接受的蛋白载体。所述的大分子聚合物可以是羧甲基纤维素，或者是检测上可接受的大分子载体。再一方面，本专利技术提供了一种筛选冠状病毒N蛋白的抗体的方法，所述的方法包括以下步骤：（1）化学合成冠状病毒N蛋白表位肽变体或者其衍生物，或将编码冠状病毒N蛋白表位肽变体的核酸连接到表达载体，导入宿主细胞内如酵母菌、大肠杆菌，在适合条件下表达所述多肽；（2）步骤（1）获得的多肽与载体蛋白或者大分子偶联；（3）偶联多肽固定于固相载体或与胶体金偶联成为金标抗原，用于捕获冠状病毒N蛋白的抗体。用于识别或者筛选冠状病毒N蛋白的抗体。再一方面，本专利技术提供了一种抗原组合物，含有：冠状病毒N蛋白表位肽变体或者其变体衍生物；和检测上可接受的稀释剂、载体或助剂。本专利技术还提供了一种检测试剂，包括冠状病毒N蛋白表位肽变体或者上述抗原组合物。较好的，所述的检测可以是侧向层析或ELISA。本专利技术还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括检测试纸,所述的检测试纸含有冠状病毒N蛋白表位肽变体。本专利技术针对新型冠状病毒抗体检测特异性低的问题，提供了一种N抗原变体，旨在提高新型冠状病毒抗体检测中抗原抗体反应的特异性，降低了与新型冠状病毒同源性高的冠状病毒抗体如SARS、人流感冠状病毒抗体的非特异性反应。所述N蛋白抗原变体包含了SARS-CoV2N蛋白原序列340-419间80个氨基酸残基的多肽，在SEQIDNO1序列的第420位添加半胱氨酸（C），或/和在SEQIDNO1序列的第342的赖氨酸（K）或/和第347的赖氨酸（K）或/和第387的赖氨酸（K）或/和第388的赖氨酸（K）突变为丙氨酸（A）。上述多肽可以用以BSA、HSA、KLH及OVA为代表的蛋白类或以羧甲基纤维素等大分子聚合物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽，其特征在于，所述的多肽是冠状病毒N蛋白表位肽，具有冠状病毒N蛋白表位肽活性并且在C端添加半胱氨酸残基；/n突变发生的氨基酸残基位点选自：/n第342的赖氨酸、第347的赖氨酸、第387的赖氨酸、第388的赖氨酸突变为同源性较低的氨基酸；/n所述的冠状病毒N蛋白编码第340-419的多肽序列为SEQ ID NO 7。/n

【技术特征摘要】
1.一种多肽，其特征在于，所述的多肽是冠状病毒N蛋白表位肽，具有冠状病毒N蛋白表位肽活性并且在C端添加半胱氨酸残基；
突变发生的氨基酸残基位点选自：
第342的赖氨酸、第347的赖氨酸、第387的赖氨酸、第388的赖氨酸突变为同源性较低的氨基酸；
所述的冠状病毒N蛋白编码第340-419的多肽序列为SEQIDNO7。


2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的突变发生的氨基酸残基突变为丙氨酸。


3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽的序列为SEQIDNO2-SEQIDNO6中任意一条所示。


4.根据权利要求1所述的多肽的应用，其特征在于，所述的多肽作为检测冠状病毒N蛋白的标志物，用于捕获或者筛选识别冠状病毒N蛋白的抗体。


5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
制备权利要求1-3中任意一种多肽；和/或
将权利要求1-3中任意一种多肽与载体蛋白或者大分子聚合物偶联；
检测识别冠状病毒N蛋白的抗体的存在。


6.根据权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔大祥，田静，王侃，刘岩磊，梁辉，李雪玲，
申请(专利权)人：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31