一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位和应用制造技术

本发明专利技术属于免疫技术领域，具体公开了一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位，具有如下氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3。本发明专利技术还公开了上述新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位的应用。本发明专利技术得到的一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位对新冠肺炎疫苗研发以及小分子药物的研发、诊断、预防和治疗具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位和应用
本专利技术属于免疫
，尤其涉及一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位和应用。
技术介绍
SARS-CoV-2属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，是目前人类已知的RNA病毒中基因组最大的病毒，其长度为27至32kb，并具有至少4个主要结构蛋白，包括刺突蛋白(S蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)，病毒进入细胞取决于S蛋白和S蛋白的受体结合域(RBD)，S蛋白有S1和S2两个亚基，受体结合位点(RBD)位于S1亚基上，其主要功能是识别宿主细胞表面受体，介导与宿主细胞的融合；N蛋白是一种碱性磷蛋白，其中央区与病毒基因组RNA结合，形成卷曲的核衣壳螺旋，是包裏病毒遗传物质的核心结构，是在感染细胞中是表达量最高的病毒蛋白之一。新冠病毒抗原表位的研究对于新冠病毒的预防、检测、诊断和治疗均具有重要意义。申请公开号为CN111440229A的中国专利技术专利申请公开了一种新冠病毒T细胞表位，该专利利用IEDB资源ClassIImmunogenicity工具预测了新冠病毒N蛋白的T细胞表位，分析了600个具有免疫原性、181个不具有免疫原性的9mer肽，但是目前还未有文献报道B细胞识别的线性抗原表位。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够被B细胞识别的一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位和应用。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位，具有如下氨基酸序列：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3。本专利技术还提供了一种编码线性抗原表位的核酸。本专利技术还提供了一种包括核酸的重组载体。本专利技术还提供了一种上述核酸或导入了上述重组载体的宿主细胞。本专利技术还提供了一种疫苗，包括以下任一项：(1)以本专利技术所提供的线性抗原表位作为有效成分；(2)以本专利技术所提供的核酸作为有效成分；(3)以本专利技术所提供的重组载体作为有效成分。本专利技术还提供了一种检测试纸或者检测试剂，包括本专利技术所提供的线性抗原表位。本专利技术的原理和有益效果在于：本专利技术获得的线性表位对于新冠病毒检测、诊断、疫苗研发和治疗药物的研发均具有广泛的应用前景，例如，使用本专利技术所提供的线性表位检测患者体内的抗体滴度，检测接种新冠疫苗后的体液免疫反应状态，可以用于小分子药物开发、疫苗研发等。附图说明图1为实验一中新冠病毒RBD特异性抗体与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3抗原结合的ELISA结果图；图2为实验二中新冠病毒线性表位SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3与患者血浆结合，而与健康人不结合的实验结果图；图3为实验三中新冠病毒线性表位SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3与RBD受体ACE2结合的实验结果图；图4为采用流式细胞仪分析RBD特异性记忆B细胞的细胞分选图图5为采用流式细胞仪分析RBD特异性记忆B细胞的细胞分选图；图6为单细胞抗体基因PCR产物凝胶电泳图；图7为PCR扩增包含CMV启动子、WPRE-γ或WPRE-κ元件抗体基因表达盒后的琼脂糖凝胶电泳图；图8为CQTS050和CQTS074的RBD特异性检测结果图；图9为CQTS126的RBD特异性检测结果图。具体实施方式下面通过具体实施方式进一步详细说明：实施例1本实施例提供一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位，具有如下氨基酸序列：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3。本实施例还提供上述新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位在制备核酸、重组载体、宿主细胞、组合物、疫苗、检测试纸、检测试剂或者单克隆抗体方面的应用。实施例2和实施例3实施例2、实施例3与实施例1的区别在于：氨基酸序列不同，实施例2和实施例3的序列如下表所示：实验组氨基酸序列(N'-C')实施例1-SEQIDNO:1NLCPFGEVFNATRFASVYAW实施例2-SEQIDNO:2NNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKP实施例3-SEQIDNO:3PTNGVGYQPYRVVVLSFELL实验一：实施例1-3提供的一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位，通过以下方法得到：目前，有多篇文献报道通过结构分析新冠病毒S蛋白、RBD蛋白或其抗体与其受体ACE2的空间结构的关键氨基酸或氨基酸位点，但是有关新冠抗体线性表位的报道很少，例如MiningofepitopesonspikeproteinofSARS-CoV-2fromCOVID-19patients(CellResearch(2020)0:1–3；https://doi.org/10.1038/s41422-020-0366-x)是通过软件预测S蛋白的抗原表位，通过新冠肺炎患者恢复期血液分析，但不是通过单克隆抗体验证的。本实施例是RBD蛋白进行抗原线性表位段的合成而获得线性氨基酸肽段。本实施例从设计抗原表位方法不同，同时发现的线性抗原表位也不一样，具体包括以下步骤：1.设计RBD抗原肽段并合成实施例1-3的氨基酸肽；2.ELISA法检测抗原线性表位的抗体结合能力，筛选线性抗原表位，具体原理在于：若抗体表位为空间表位，经SDS，巯基乙醇、DTT等处理后，空间构象被破坏，此时抗体不能识别。若为线性表位，则抗体依然能结合。(1)耗材和试剂：链霉亲和素涂层板(ThermoFisher，P#15504)；WashBuffer(使用Protein-FreeBlockingBuffers配制，P#37573)，在上述Buffer的基础上加入0.1％BSA(biofroxx,P#)；山羊F(ab')2抗人IgG(Fab')2的购买信息为AlkalinePhosphatase、Abcam,P#ab98532；PNPPSubstrate的购买信息为ThermoFisher、P#34045。(2)第一天：RBD化学合成的抗原肽使用PBS稀释(终浓度20μg/ml)，10μl/孔，包被384孔ELISA板在4℃下过夜或37℃下包被2h(本实施例优选在4℃下过夜)。NOTE：加完后瞬时离心。包被板的购买信息为CORNING，HighBinding，Lot#20519008。(3)第二天：(a1)配制PBST(0.05％Tween20，Cat#TB220)：1L的PBS中加入0.5ml的Tween20；PBST机洗板子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位，其特征在于，具有如下氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3。/n

【技术特征摘要】
1.一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位，其特征在于，具有如下氨基酸序列：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3。


2.根据权利要求1所述的一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位，其特征在于，通过以下步骤得到：首先对新冠病毒的S蛋白或新冠病毒的RBD蛋白进行变性反应后，再用新冠病毒特异性单克隆抗体与变性反应后的S蛋白或RBD蛋白进行结合试验，再将S蛋白或RBD蛋白进行抗原线性表位段的合成而获得线性表位。

【专利技术属性】
技术研发人员：金艾顺，李婷婷，韩晓建，王应明，李胜龙，王建为，胡超，申美莹，
申请(专利权)人：重庆医科大学，冯玉林，
类型：发明
国别省市：重庆;50