一种重组新型冠状病毒COVID-19 S-RBD蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种重组新型冠状病毒COVID‑19 S‑RBD蛋白及其制备方法和应用。所述的制备方法通过将人工合成的S‑RBD融合蛋白基因构建进大肠杆菌表达系统，再通过特殊的包涵体复性技术，获得了表达量高、具有抗原性的可溶性纯化重组COVID‑19 S‑RBD蛋白；该重组蛋白制备方法操作简便、生产成本低廉、效率高，并且制得的重组蛋白可以用于制备检测新冠病毒的试剂条；该试剂条的使用效果经过本发明专利技术的验证，检测结果准确、效率高、结果通俗易懂，特别适用于大量人群的新冠病毒快速筛查。

【技术实现步骤摘要】
一种重组新型冠状病毒COVID-19S-RBD蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种重组新型冠状病毒COVID-19S-RBD蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
冠状病毒是一个大型病毒家族，是许多家畜、宠物包括人类疾病的重要病原，可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。冠状病毒在系统分类类别属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。新型冠状病毒(COVID-19)属于β冠状病毒的Sarbecovirus亚属，是一类具有包膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，其颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140nm。新型冠状病毒感染后的临床症状与SARS病毒相似，从基因序列同源性上来说，COVID-19病毒基因组与SARS病毒具有80％的相似性，SARS-Cov-2与MERS-CoV的基因序列有40％的相似性。新型冠状病毒的传播途径主要是呼吸道飞沫传播和接触传播等，不同年龄段的人均可被感染，其中老年人、抵抗力较差以及守护在防疫一线工作人员为易感人群。判别是否受到COVID-19病毒感染是临床诊断、治疗中一个非常重要的环节，而血清学检定病毒特异性抗体是其中一个重要的方式。COVID-19S蛋白中的受体结合区域(RBD)是病毒与上皮黏膜细胞表面ACE2受体的特定结合位点，感染COVID-19病毒后人体会产生针对病毒RBD的特异性抗体，因此检测RBD抗体也是临床诊断COVID-19病毒感染的一个重要指标，重组RBD抗原可以用于各类检测特异性抗体的诊断试剂。目前，通常选择在动物细胞如HEK-293、CHO细胞中表达重组蛋白，但这些细胞的蛋白表达量低，且生产工艺复杂，成本很高。虽然大肠杆菌表达系统表达的重组蛋白表达量较高，操作简便，但翻译后在蛋白折叠、修饰方面和天然蛋白之间可能会存在较大差异，而这种差异就会影响重组蛋白的抗原性，降低其检测性能。因此，现在需要一种既能够保证重组蛋白表达量高，又能极大降低重组蛋白及自然蛋白之间差异的重组蛋白制备方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种重组新型冠状病毒COVID-19S-RBD蛋白及其制备方法和应用。本专利技术采用原核系统大肠杆菌表达系统，经重组、表达、纯化和透析复性得到了高表达的重组新型冠状病毒COVID-19S-RBD蛋白，可利用该蛋白制备检测新冠病毒的检测试剂卡，使用简单，效果好。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种重组新型冠状病毒COVID-19S-RBD蛋白的制备方法，具体包括如下步骤：(1)将合成的S-RBD融合蛋白基因克隆到pET-28a载体中，并筛选出正确的阳性单克隆制成穿刺菌；将穿刺菌在含50μg/ml卡那霉素的LB平板上划线后37℃培养过夜，次日从LB平板上挑取单克隆菌落接种至含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养至菌液浓度OD600为1.5～2.0；提取质粒，得到S-RBD蛋白表达质粒；(2)将S-RBD蛋白表达质粒加入解冻的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰上放置30min，42℃水浴热击90～120s，再冰浴5min，加入无抗性LB液体培养基，37℃水浴1h，将菌液涂布于含卡那霉素的LB固体培养基平板上，倒置平板37℃培养12～16h；(3)从上述平板上挑选单菌落加入含20～50μg/ml卡那霉素的超级肉汤培养基(SB)中，37℃恒温培养摇床250rpm转速摇菌至菌液浓度OD600为1.2～1.5，取1ml菌液加至1L含20～50μg/ml卡那霉素的超级肉汤培养基(SB)中，37℃恒温培养摇床250rpm转速摇菌至菌液浓度OD600为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.1mM，将恒温摇床温度调至28℃，250rpm诱导7h；离心收集菌体；(4)将得到的菌体按1g菌体15ml缓冲液的比例与缓冲液充分混匀，超声破碎20min，离心，沉淀分别在缓冲液中漂洗、离心，收集沉淀包涵体；(5)将沉淀包涵体按照15ml/g比例用含8M脲素的缓冲液溶解、超声破碎、离心，得到的上清液蛋白使用镍亲和层析柱纯化，收集洗脱液；(6)洗脱液中加入还原剂β-巯基乙醇至终浓度20mM，装入透析袋中梯度透析，透析结束后离心、收集上清，得到的上清蛋白即为重组新型冠状病毒COVID-19S-RBD蛋白。进一步的，所述步骤(1)中成S-RBD融合蛋白基因的DNA序列如SEQIDNo.1所示，氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。进一步的，所述步骤(6)中洗脱液与透析液的体积比为1:100。进一步的，在透析过程中，每4h更换一次缓冲液，全程4℃搅拌透析。进一步的，所述透析液的更换顺序依次为透析液1、透析液2、透析液3、透析液4。进一步的，透析液1包括pH为8.0的20mMTris-HCl，4M脲素、1mMEDTA、1mMβ-巯基乙醇、0.1％Tween-80、0.1M精氨酸。进一步的，透析液2包括pH为8.0的20mMTris-HCl、2M脲素、1mMEDTA、1mMβ-巯基乙醇、0.1％Tween-80、0.1M精氨酸。进一步的，透析液3包括pH为8.0的20mMTris-HCl、1M脲素、1mMEDTA、1mMβ-巯基乙醇、0.1％Tween-80、0.1M精氨酸。进一步的，透析液4为pH为7.4的PBS。本专利技术还提供了由所述的制备方法制备得到的重组新型冠状病毒COVID-19S-RBD蛋白。本专利技术还提供了所述的重组新型冠状病毒COVID-19S-RBD蛋白在制备用于筛查新型冠状病毒的检测器械中的应用。进一步的，所述检测器械为新冠病毒特异性抗体IgG/IgM检测试剂(胶体金法)。进一步的，所述新冠病毒特异性抗体IgG/IgM检测试剂(胶体金法)为S-RBD蛋白胶体金检测试剂卡。进一步的，所述S-RBD蛋白胶体金检测试剂卡的制备方法包括以下步骤：(1)将所述COVID-19S-RBD蛋白加入添加了K2C03的胶体金中混匀，使用BSA封闭后离心取上清液，加入100μl纯水得到胶体金工作液1；(2)将鸡IgY抗体加入添加了K2C03的胶体金中混匀，使用BSA封闭后离心取上清液，加入100μl纯水得到胶体金工作液2；(3)将胶体金工作液1和胶体金工作液2混匀，使用稀释液(PBS+2％海藻糖)稀释制成铺金稀释液，加入胶体金工作液1的体积为最终铺金稀释液体积的1/8，加入胶体金工作液2的体积为最终铺金稀释液体积的1/50；按照每cm2玻纤使用88μl铺金稀释液的比例，将铺金稀释液均匀地喷洒在玻纤上，烘干制得胶体金垫；(3)使用稀释液(PBS+2％海藻糖)稀释鼠抗人IgG抗体、鼠抗人IgM抗体、羊抗鸡IgY抗体至终浓度为1mg/ml，并分别划于硝酸纤维素膜上作为检测线G、检测线M以及质控线C，烘干得到硝酸纤维素抗体膜；(4)将所述胶体金垫和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组新型冠状病毒COVID-19 S-RBD蛋白的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：/n(1)将合成的DNA序列如SEQ ID No.1所示的S-RBD融合蛋白基因构建进大肠杆菌质粒中，得到S-RBD蛋白表达质粒；/n(2)将所述S-RBD蛋白表达质粒转化进大肠杆菌感受态细胞中培养，并挑选单菌落诱导表达后，离心收集菌体；/n(3)将得到的菌体在缓冲液中超声破碎，离心后再在缓冲液中漂洗2次，离心得到沉淀包涵体；/n(4)将沉淀包涵体溶解、超声破碎、离心后得到的上清液使用层析柱纯化洗脱纯化，收集洗脱液；/n(5)将洗脱液中加入还原剂后装入透析袋进行透析，得到的透析液经离心收集上清，则得到重组新型冠状病毒COVID-19 S-RBD蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组新型冠状病毒COVID-19S-RBD蛋白的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)将合成的DNA序列如SEQIDNo.1所示的S-RBD融合蛋白基因构建进大肠杆菌质粒中，得到S-RBD蛋白表达质粒；
(2)将所述S-RBD蛋白表达质粒转化进大肠杆菌感受态细胞中培养，并挑选单菌落诱导表达后，离心收集菌体；
(3)将得到的菌体在缓冲液中超声破碎，离心后再在缓冲液中漂洗2次，离心得到沉淀包涵体；
(4)将沉淀包涵体溶解、超声破碎、离心后得到的上清液使用层析柱纯化洗脱纯化，收集洗脱液；
(5)将洗脱液中加入还原剂后装入透析袋进行透析，得到的透析液经离心收集上清，则得到重组新型冠状病毒COVID-19S-RBD蛋白。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中诱导表达是在含20～50μg/ml卡那霉素的超级肉汤培养基中完成的。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中在透析过程中每4h更换一次缓冲液，在4℃搅拌透析；缓冲液的更换顺序为缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3、PBS缓冲液更换2次；其中缓冲液1包括20mMTris-HCl，4M脲素、1mMEDTA、1mMβ-巯基乙醇、0.1％Tween-80、0.1M精氨酸；缓冲液2包括20mMTris-HCl、2M脲素、1mMEDTA、1mMβ-巯基乙醇、0.1％Tween-80、0.1M精氨酸；缓冲液3包括20mMTris-HCl、1M脲素、1mMEDTA、1mMβ-巯基乙醇、0.1％Tween-80、0.1M精氨酸。


4.由权利要求1所述的制备方法制备得到的重组新型冠状病毒COVID-19S-RBD蛋白。


5.权利要求4所述的重组新型冠状病毒COVID-19S-RBD蛋白在用于制备筛查新型冠状病毒的检测器械中的应用。


6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：付理文，刘艳慧，娄珺，周伟，刘容，
申请(专利权)人：上海捷门生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31