本发明专利技术公开了一种特异性抗噻虫胺抗体的可变区序列，重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术还公开了一种抗噻虫胺重组完整抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术又公开了一种抗体表达质粒。本发明专利技术再公开了一种快速检测噻虫胺残留的免疫试纸条。将本发明专利技术得到的序列基因分别连接到包含了重链恒定区基因和轻链恒定区基因的表达载体，采用双质粒系统的哺乳动物细胞表达获得了重组完整抗体，保证了鼠源亲本抗体的识别活性，并使得抗噻虫胺抗体可大批量稳定生产，为噻虫胺残留检测的各种免疫分析方法提供了可靠的核心试剂。
【技术实现步骤摘要】
一种特异性抗噻虫胺抗体的可变区序列及其重组完整抗体的制备与应用
本专利技术属于基因工程
，尤其是涉及一种特异性抗噻虫胺抗体的可变区序列及其重组完整抗体的制备与应用。
技术介绍
噻虫胺是一种具有噻唑环的新型烟碱类杀虫剂，因其结构独特，性能与传统烟碱类杀虫剂相比更为优异，而被广泛应用于防治各种害虫对农作物的危害。噻虫胺有卓越的内吸和渗透作用，因此会分布在作物各个部位，且因其具有水溶性强和半衰期长等特点，很容易通过降雨和灌溉等途径进入到地表水和土壤中。研究表明，地表水、沉积物和土壤中存在着较高水平的噻虫胺残留，这些农药残留对生态健康和非目标传粉动物及水生无脊椎动物造成巨大威胁。欧盟现已禁止噻虫胺在室外环境下使用，在欧盟标准中，不同的食品中噻虫胺的最大残留限量(MRLs)为0.01-1.5mg/mg，在中国，噻虫胺的MRLs设定为0.01-2mg/kg。为防止消费者和有益生物受到噻虫胺残留的危害，对环境和农产品中的噻虫胺的监测具有重要的意义。目前，针对噻虫胺的检测方法主要有基于仪器的检测方法和基于免疫分析的检测方法。仪器分析方法有HPLC、GC和MS等，这些仪器分析方法均具有很高精密度、准确度和灵敏度，能够满足噻虫胺的精准定性定量的检测要求，但仪器分析方法需要昂贵的分析仪器、专业的实验人员和复杂的样品前处理程序，因此很难实现大规模的现场快速分析，而免疫分析快速检测方法能满足农药残留现场检测以及大批量样本筛查的需求。国内外虽然已经有抗噻虫胺单抗的相关报道，但是这些抗体均与呋虫胺有一定的交叉反应。李明等报道了抗噻虫胺单抗的制备和应用，其抗体灵敏度(抑制中浓度IC50)为26.6ng/mL，与呋虫胺的交叉反应率为47.8％(Detectingclothianidinresiduesinenvironmentalandagriculturalsamplesusingrapid,sensitiveenzyme-linkedimmunosorbentassayandgoldimmunochromatographicassay.SCITOTALENVIRON2014,499:1-6)。Uchigashima等报道的抗噻虫胺抗体的IC50为4.4ng/mL，与呋虫胺的交叉反应率为64％(DevelopmentofImmunoassayBasedonMonoclonalAntibodyReactedwiththeNeonicotinoidInsecticidesClothianidinandDinotefuran.SENSORS-BASEL2012,12(11):15858-15872)。呋虫胺是一种与现有的新烟碱类农药的化学结构有着很大差别的新烟类农药，因其具有很广的杀虫谱，并对作物、人畜和环境又十分安全，在实际生产中使用量不低于噻虫胺，其理化性质和其他新烟碱类农药相似，因此环境中也经常存在着呋虫胺残留。将与能交叉识别呋虫胺的抗噻虫胺单抗用于免疫分析快速检测，在实际现场检测工作中，无法快速区分噻虫胺和呋虫胺，因此急需研制高特异、高灵敏的抗噻虫胺抗体。农药免疫分析快速检测技术是基于农药抗原和抗体的特异性结合而实现的，故抗体的制备是农药免疫快速检测的核心关键。传统的抗体有多克隆抗体和单克隆抗体，均是通过免疫动物而制备的，且后者因只有一个抗原识别表位特异性强而被广泛应用于农药免疫分析快速检测。依赖杂交瘤细胞制备单克隆抗体这一技术生产成本高、耗时，且需要杂交瘤细胞的长期低温保存和定期驯化，但在这些过程中杂交瘤细胞会因保存条件不当，有效基因丢失或突变而无法产生有效的抗体。随着基因工程技术的发展，序列明确的重组抗体逐渐变成研究热点，包括单链抗体、Fab抗体、重组完整抗体等。在众多重组抗体表达系统中，哺乳动物细胞表达系统能够指导重组抗体的正确折叠，提供准确的多种翻译后的加工和修饰功能，因此可以稳定产生与亲本抗体活性一致的重组抗体，不仅证实了亲本抗体可变区序列的准确性，还可以解决常规抗体制备面临的许多问题，如传统抗体的批次间差异、细胞株传代保存过程中容易丢失有效基因而导致细胞株无法产生有效抗体。只要获得正确的抗体序列基因，就可以在体外大量制备多种形式的重组抗体(包括全长IgG完整抗体、单链抗体scfv、抗原识别片段Fab等)，而无需牺牲小鼠来制备腹水抗体，操作简便，制备周期短，有利于大规模产生抗体，并有助于灵敏、可靠的农药残留快速检测技术的发展和应用。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种灵敏度高、特异性强的抗噻虫胺重组完整抗体的制备方法和稳定生产，以及该抗体的应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种特异性抗噻虫胺抗体的可变区序列，重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。作为优选，重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。作为优选，轻链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQIDNO:4所示。作为优选，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术还公开了一种抗噻虫胺重组完整抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，所述重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQIDNO:2所示。作为优选，所述重链可变区编码基因的核苷酸序列为如SEQIDNO:1所示。作为优选，所述轻链可变区编码基因的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。作为优选，所述轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术又公开了一种抗体表达质粒，含有上述任一项所述的重链可变区和小鼠重链IgG1恒定区的核苷酸序列，可以表达抗噻虫胺重组完整抗体的重链蛋白；或者，含有如权利要求2-3中任一项所述的轻链可变区和小鼠轻链Kappa恒定区的核苷酸序列，可以表达抗噻虫胺重组完整抗体的轻链蛋白。本专利技术再公开了一种快速检测噻虫胺残留的免疫试纸条，含有如上述所述的抗噻虫胺重组完整抗体。本专利技术将一株能稳定分泌抗噻虫胺高特异、高灵敏单抗的杂交瘤细胞株的重链和轻链可变区基因成功扩增出来、测序和合成，采用同源重组技术分别构建了重链和轻链表达载体，并共转染至哺乳动物细胞HEK293F中，最终获得抗噻虫胺的重组完整抗体。经ELISA和表面等离子共振(SPR)技术验证，该重组完整抗体与传统的抗噻虫胺小鼠腹水单抗相比，有一致的高灵敏度和高选择性，可以代替腹水单抗，应用于噻虫胺农药残留检测。利用该重组完整抗体制备的噻虫胺金标试纸条，利用该重组完整抗体构建免疫分析方法，用于环境和农产品中噻虫胺残留的快速检测，其检出限低至2.5ng/mL。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术公开的抗噻虫胺重组完整抗体的重链可变区、轻链可变区序列来源于经多次免疫小鼠、细胞融合及筛选得到的一株高特异性的抗噻虫胺的单克隆细胞株。将此序列基因分别连接到包含了重链恒定区基因和轻链恒定区基因的表达载体，采用双质粒系统的哺乳动物细胞表达获得了重组完整抗体，保证了鼠源亲本抗体的识别活性，并使得抗噻虫胺抗体可大批量稳定生产，为噻虫胺残留检测的各种免疫本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性抗噻虫胺抗体的可变区序列，其特征在于：重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种特异性抗噻虫胺抗体的可变区序列，其特征在于：重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。
2.根据权利要求1所述的特异性抗噻虫胺抗体的可变区序列，其特征在于：重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
3.根据权利要求1或2所述的特异性抗噻虫胺抗体的可变区序列，其特征在于：轻链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQIDNO:4所示。
4.根据权利要求3所述的特异性抗噻虫胺抗体的可变区序列，其特征在于：轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
5.一种抗噻虫胺重组完整抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其特征在于：所述重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQIDNO:2所示。
6.根据权利要求5所述的抗噻虫胺重组完整抗体...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭逸蓉，常云云，赵颖，刘鹏琰，柳颖，焦沙沙，张天宜，朱国念，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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